一种测定枸橼酸根及乌头酸含量的方法技术

本申请公开了一种测定枸橼酸根和乌头酸含量的方法，包括了供试品溶液的制备，对照品溶液的制备以及系统适用性溶液的制备，利用了特定的色谱条件，不仅仅采用直接法测定得到了枸橼酸根的含量，还测出了里面杂质乌头酸的含量。本测定方法准确、精密、重现性好及重复性好，使用的仪器应用广泛，耗材成本低。

A method for the determination of citrate and aconitic acid

【技术实现步骤摘要】
一种测定枸橼酸根及乌头酸含量的方法
本专利技术属于药物分析
，具体涉及同时测定枸橼酸根和乌头酸含量的方法。
技术介绍
枸橼酸氢钾钠（PotassiumSodiumHydrogenCitrate），又名柠檬酸氢钾钠，商品名叫友来特（Uralyt-U），是由德国马博士大药厂（MadausGmbH）公司1977年研究开发的一类治疗尿道结石的药物，其为颗粒剂，属于有机无机复盐体系，在临床上用于溶解尿酸结石和防止新结石的形成，作为胱氨酸结石和胱氨酸尿的维持治疗且已经得到广泛应用，其结构是一定晶型存在的复盐形式，而不是简单的混合物。枸橼酸氢钾钠既符合生理性离子配比，又能碱化尿液，减少尿中钙离子浓度，提高尿液中结晶抑制因子（枸橼酸盐）的浓度。枸橼酸氢钾钠作为复盐形式存在，有着独特的离子配比，即其中的钾离子K+：钠离子Na+：氢离子H+：枸橼酸根离子C6O7H5-3的摩尔比为6：6：3：5，整体呈现电中性。符合人体的生理离子配比，安全性高，不会引起电解质紊乱；同时也有着人性化的设计，可根据pH值调整用药量，服用更科学；生物利用度高、药效稳定，有效期长达5年。经过多个国家、几十年临床验证：安全、快速、无毒副作用、可长期服用。枸橼酸氢钾钠除用于溶解尿酸结石和防止新结石的形成，作为胱氨酸结石的胱氨酸尿的维持治疗外，还可以协同体外碎石，提高碎石效果，促进残石溶解和排净，用于各种代谢性疾病（痛风、肾小管性酸中毒等）的辅助治疗。随着尿石症患者和痛风、高尿酸血症等代谢性疾病患者逐年增加，其市场潜力巨大。枸橼酸氢钾钠在制备的过程中因为暴露在高温条件下，枸橼酸极容易脱去一分子的水，产生杂质失水枸橼酸，也叫做乌头酸，两者化学结构式如下式所示：枸橼酸，乌头酸。过往的专利报告或者文献中，都只是单单对枸橼酸根的含量进行测定，而没有讲乌头酸的含量计算在内，而在制备的过程中，不可避免的会产生较大量的乌头酸，从而使得忽视乌头酸含量的测定对后续的精确实验影响较大。在进口注册标准JX20040251中，枸橼酸根含量测定方法为酶法-紫外分光光度法。其原理如下所示：第一步：枸橼酸盐在枸橼酸裂解酶的作用下，生成草酰乙酸盐和乙酸盐。第二步：草酰乙酸盐+NADH+H+在苹果酸脱氢酶的作用下，生成了苹果酸及NAD-。然后在通过紫外分光光度计测量340nm下,吸光度的变化来计算枸橼酸盐的量。因为NADH在340nm条件下有吸收峰。空白溶液中不含枸橼酸盐，NADH不发生反应。供试品溶液中，含有枸橼酸盐，通过两步酶参与的反应，消耗一定量的NADH，从而导致吸光度变化。通过测量NADH在340nm下吸光度的变化来计算NADH的量的变化，从而计算枸橼酸盐的量。此方法的优点是酶参与的化学反应，专属性强，适用于生物样品中枸橼酸盐的测定。但是其缺点为操作太复杂，准确性、重复性稍差；价格昂贵，且并非直接对枸橼酸含量进行测定，通过间接的变化完成测定，导致实验结果与真实值有一定的误差。在国家药品标准YBH00762010中，枸橼酸根含量测定方法为非水溶液滴定法。其方法为取本品90mg，精密称定，加冰醋酸10ml，加热溶解后，放冷，加醋酐5ml与结晶紫指示液1滴，用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定至溶液显蓝色，并将滴定液的结果用空白试验校正。此方法的优点是无需对照品，价格低廉，过程简单。但是其缺点为涉及到显色，准确度与重现性稍差。以上两种方法均存在优缺点，综合成本、方法难易程度、准确性及重现性考虑，我们需要建立一种操作简便、准确度高、重复性及重现性好，并且成本不高的枸橼酸根含量检测方法。并且进口注册标准JX20040251和国家药品标准YBH00762010中，均无关于乌头酸含量检测的方法。因此，在现有技术测定枸橼酸根存在较多问题的情况下，研发出一种可以精确测量枸橼酸根含量的方法，并同时可以测定出其中的杂质乌头酸的含量且符合操作简单，条件简单，环境污染小的方法非常有意义。
技术实现思路
本申请的主要目的是提供一种测定枸橼酸根含量的方法，在测定枸橼酸根含量的同时也将其中的杂质乌头酸一并进行测定。此测定方法是直接测定枸橼酸根的含量，避免了在先技术采用间接测定所导致的误差。为了实现上述目的及解决枸橼酸根测定当中存在的问题，本申请采用了以下技术方案：一种测定枸橼酸根及乌头酸含量的方法，采用了高效液相色谱法，包括以下步骤：（1）供试品溶液的制备：取枸橼酸氢钾钠细粉，精密称定，置于量瓶中，加稀释剂溶解并稀释，摇匀并滤过得到供试品溶液；（2）对照品溶液的制备：取枸橼酸对照品适量，加稀释剂溶解并定量稀释，作为枸橼酸对照品溶液；取反乌头酸对照品适量，加稀释剂溶解并定量稀释，作为反乌头酸对照品溶液；（3）测定：采用C18色谱柱，以磷酸调节pH值为2.2～3.2的18.2mmol/L磷酸二氢钠水溶液-异丙醇为流动相，精密量取空白溶液、系统适用性溶液、反乌头酸对照品溶液和供试品溶液，注入色谱仪，记录色谱图。枸橼酸根计算公式如下：响应因子（f）=Ar*192.12/Cr*189.1枸橼酸根含量（%）=A*V/f平均值*m*（1-干燥失重）*100%其中：Cr—枸橼酸对照品溶液浓度（mg/ml）；Ar—枸橼酸对照品溶液主峰面积；A—供试品溶液中主峰面积；m—供试品称样量（mg）；V—供试品稀释体积（ml）乌头酸计算公式如下：响应因子(f)=Ar/Cr乌头酸(%)=[(A1+A2)*v]/[f平均值*w*m*(1-干燥失重)]*100%其中：Cr—反乌头酸对照品溶液浓度（mg/ml）；Ar—反乌头酸对照品溶液峰面积；A1、A2—供试品溶液中顺、反乌头酸峰面积；w—供试品溶液中枸橼酸根含量；m—供试品称样量（mg）V—供试品溶液体积（ml）。系统适用性溶液由枸橼酸对照品、顺乌头酸对照品、反乌头酸对照品，用稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含枸橼酸根3.2mg、顺乌头酸4.8µg、反乌头酸4.8µg的混合溶液。用以确定当次分析使用的色谱系统是有效的、适用的。优选的，磷酸二氢钠与异丙醇的体积比为1000:1。优选的，精密量取并注入色谱仪的空白溶液、系统适用性溶液、反乌头酸对照品溶液和供试品溶液为各20µl。对于色谱条件的限定，我方技术方案的液相色谱的分析条件包括以下（ⅰ）至（ⅶ）中的一项或者多项：（ⅰ）色谱柱的规格为4.6*250mm，5um；（ⅱ）色谱柱的型号选自AgilentZORBAXSBC18、CAPCELLPAKC18、ApolloC18、UltimateAQC18当中的一种；（ⅲ）色谱柱温度为35±5℃；（ⅳ）流速为0.9～1.1ml/min；（ⅴ）进样量为5～30μl；（ⅵ）检测波长为210～240nm。我方的技术方案还包括了此测定方法在药物分析检测当中的应用。由本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定枸橼酸根及乌头酸含量的方法，采用了高效液相色谱法，其特征在于，包括以下步骤：/n（1）供试品溶液的制备：取枸橼酸氢钾钠细粉，精密称定，置于量瓶中，加稀释剂溶解并稀释，摇匀并滤过得到供试品溶液；/n（2）对照品溶液的制备：取枸橼酸对照品适量，加稀释剂溶解并定量稀释，作为枸橼酸对照品溶液；/n取反乌头酸对照品适量，加稀释剂溶解并定量稀释，作为反乌头酸对照品溶液；/n（3）测定：采用C18色谱柱，以磷酸调节pH值为2.2～3.2的18.2mmol/L磷酸二氢钠水溶液-异丙醇为流动相，精密量取空白溶液、系统适用性溶液、反乌头酸对照品溶液和供试品溶液，注入色谱仪，记录色谱图。/n

【技术特征摘要】
1.一种测定枸橼酸根及乌头酸含量的方法，采用了高效液相色谱法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：取枸橼酸氢钾钠细粉，精密称定，置于量瓶中，加稀释剂溶解并稀释，摇匀并滤过得到供试品溶液；
（2）对照品溶液的制备：取枸橼酸对照品适量，加稀释剂溶解并定量稀释，作为枸橼酸对照品溶液；
取反乌头酸对照品适量，加稀释剂溶解并定量稀释，作为反乌头酸对照品溶液；
（3）测定：采用C18色谱柱，以磷酸调节pH值为2.2～3.2的18.2mmol/L磷酸二氢钠水溶液-异丙醇为流动相，精密量取空白溶液、系统适用性溶液、反乌头酸对照品溶液和供试品溶液，注入色谱仪，记录色谱图。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述系统适用性溶液由枸橼酸对照品、顺乌头酸对照品、反乌头酸对照品，用稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含枸橼酸根3.2mg、顺乌头酸4.8µg、反乌头酸4.8µg的混合溶液。

【专利技术属性】
技术研发人员：任超，陈熠，潘诚成，
申请(专利权)人：湖南九典制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43