用于微卫星不稳定检测的引物组和方法技术

本发明专利技术涉及核酸检测技术领域，具体涉及用于微卫星不稳定检测的引物组和方法。本发明专利技术通过在引物的5’端添加0～25个碱基使得各引物的扩增产物长度差异至少为15bp，实现了无需荧光标记，即可在一个PCR反应体系中同时检测6个微卫星位点，有效避免了荧光标记产生的荧光干扰问题，操作步骤简单，降低了检测成本且安全性更高、通量更灵活，具有较高的扩增效率和特异性，可适用于新鲜样本和降解严重的FFPE样本，具有广泛的应用前景。

Primer set and method for microsatellite instability detection

【技术实现步骤摘要】
用于微卫星不稳定检测的引物组和方法
本专利技术涉及核酸检测
，具体涉及用于微卫星不稳定检测的引物组和方法。
技术介绍
微卫星(microsatellite，MS)是基因组中小于10个核苷酸的短串联重复序列，一般长度为1-6个核苷酸。微卫星存在于整个基因组中，常见于基因的内含子中，在启动子、转录非翻译区(UTR)和外显子中也有分布。在人基因组中，预测至少存在50万个MS位点。微卫星不稳定(microsatelliteinstability,MSI)是由于DNA错配修复系统(DNAmismatchrepairsystem，MMR)出现缺陷而造成的复制错误(replicationerror,RER)引起的简单序列的增加或减少，也就是微卫星长度的增加或减少。因此，MSI也称为RER表型。错配修复系统缺陷主要包含两种：(1)错配修复基因MLH1、MSH2、MSH6和PMS2中的一个或者多个发生胚系突变，导致错配修复缺陷；(2)MLH1启动子区域的超甲基化。研究表明，约15％的结直肠癌患者表现为微卫星高不稳定(MSI-H)，90％以上的遗传性非息肉病性大肠癌(hereditarynon-polyposiscolorectalcancer，HNPCC)患者具有MSI-H特征。MSI-H现象也会散发在子宫内膜癌、卵巢癌、胃癌等多种癌症中。1993年，Altonen首先在HNPCC细胞中发现大量MSI现象。1997年，确定了MSI的学术名称、定义、检测方法、在CRC和其他癌症中的水平等各项相关标准，其中包括5个检测MSI的参考marker(Bat25,Bat26,5S346,D2S123,D17S250，也称为Bethesdapanel)，该方法采用PCR联合变性电泳检测。由于经实验证明双碱基marker的特异性没有单碱基marker高，因此，在2002年NCI会议上，对Bethesdapanel重新进行评定，建议采用单碱基和五碱基marker。Bacher等人采用荧光PCR联合毛细管电泳的方法筛选了266个MSI位点，确定了由7个markers组成的检测Panel，包括BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24和MONO-27(MSI级别判定)以及PentaC和PentaD(识别潜在样品混杂和交叉污染)。Promega公司开发了包括BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24和MONO-27(MSI级别判定)以及Amel、PentaC和PentaD(识别潜在样品混杂和交叉污染)的MSI检测试剂盒，并通过了FDA批准。MSI的PCR检测方法是判断微卫星不稳定的金标准：存在2个及以上微卫星位点不稳定的样本判断为微卫星高不稳定样本(MSI-H)、存在1个微卫星位点不稳定的样本判断为微卫星低不稳定样本(MSI-L)或微卫星稳定(MSS)。研究表明检测患者的MSI分型具有重要临床意义。II期结直肠癌患者中，MSI-H表型的患者预后良好；但是，MSI-H表型的患者不能从5-氟尿嘧啶治疗中获益。用于微卫星不稳定检测的样本类型通常包括新鲜组织和FFPE样本。其中，FFPE样本的DNA降解严重，故MSI的PCR产物不能太长，否则会导致扩增失败、无扩增产物。为实现对降解严重的FFPE样本进行有效的检出，一般设计MSI的PCR产物大小为80～200bp。此外，在一个PCR反应体系中实现多个微卫星位点的检测，PCR产物很容易出现相互重叠的情况，造成位点的错误判断。现有技术多通过对PCR产物进行分组，使大小相近的PCR产物分到不同的组中，并采用不同的荧光标记的方式对PCR产物进行区分，再利用毛细管电泳检测不同荧光通道的片段大小，得到各个荧光通道的检测结果。然而，该方法存在以下问题：(1)荧光标记成本较高；(2)得到的PCR产物需要依赖于一代测序仪进行检测，大大增加了检测的人力、物料和时间成本以及方法的繁琐性，无法广泛推广和应用；并且使用一代测序仪时，需要用到甲酰胺进行DNA变性，而甲酰胺是高毒性物质，对操作人员的健康有潜在的影响；(3)不同荧光通道因光栅问题导致相互渗透，产生的较高背景值和非特异峰，干扰结果判读。因此，开发一种无需荧光标记、利用普通PCR、在一个反应体系中实现多个MSI位点高效检测的方法具有重要意义。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供用于微卫星不稳定的多重PCR检测引物组以及含有该引物组的试剂盒。尽管利用不同荧光标记的引物进行MSI的检测存在诸多缺陷，但是，若要实现不依赖于荧光标记、在一个PCR反应体系中同时检测多个MS位点(尤其是5个以上的位点)，需要很好地克服PCR扩增产物的区分检测问题以及各位点PCR扩增的相互影响(各引物之间以及引物与靶序列之间)等问题。尤其是，受限于MS位点的PCR扩增产物的长度，若要在较短的长度范围内有效区分不同的扩增产物更为困难。本专利技术通过在MS位点扩增引物的5’端添加0～25个碱基，使得各扩增产物之间相差15bp以上，达到非荧光标记的DNA区分检测技术的要求。在上述设计构思的基础上，本专利技术开发了针对BAT25、NR24、MONO27、BAT26、NR21、NR-27位点以及个体识别位点Amel的肿瘤细胞MSI检测引物组，该引物组在不使用荧光标记的情况下，实现了在一个PCR反应体系中同时扩增6个MS位点和1个个体识别位点、使用非荧光标记的检测技术(如毛细管电泳)即可实现各PCR扩增产物的高效检测。具体地，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供一种微卫星不稳定的多重PCR检测引物组，所述引物组中的引物包含检测靶标互补配对区和检测靶标非互补配对区；所述检测靶标非互补配对区位于所述引物的5’端，长度为0～25bp；通过调整所述引物组中各引物所述检测靶标非互补配对区的长度，使得各引物的目的扩增产物之间长度差异至少为15bp。本专利技术中，所述检测靶标互补配对区为能够与检测靶标互补配对的序列；所述检测靶标非互补配对区为无法与检测靶标序列互补配对的序列。所述通过调整各引物中所述检测靶标非互补配对区的长度，使得各引物的扩增产物之间长度差异至少为15bp具体为：根据各引物对的所述检测靶标互补配对区确定各扩增产物的长度，再综合所述引物组中各引物的扩增产物长度确定在其对应的引物5’端(在正向引物和/或反向引物的5’端)添加碱基的数目，在满足添加碱基的数目为0～25个的情况下，使得各扩增产物之间的长度差异至少为15bp。为保证引物的扩增效率，在5’端添加的序列应尽量不影响引物与靶序列的结合和扩增，同时，应尽量降低非特异性扩增的发生。本专利技术中，所述引物组中的引物无荧光标记修饰。在一个反应体系中能够同时扩增的MS位点数目受到扩增产物长度的限制。具体地，当所述扩增产物的长度为80～200bp时，所述引物组包含的用于扩增微卫星不稳定标记的引物对不超过10个。本专利技术提供一种微卫星不稳定检测试剂盒，其包含所述微卫星不稳定的多重PCR检测引物组。进一步地，基于上述微卫星不稳定的多重PCR检测引物组的设计构思，针对特定本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种微卫星不稳定的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述引物组中的引物包含检测靶标互补配对区和检测靶标非互补配对区；所述检测靶标非互补配对区位于所述引物的5’端，长度为0～25bp；通过调整所述引物组中各引物所述检测靶标非互补配对区的长度，使得各引物的目的扩增产物之间长度差异至少为15bp。/n

【技术特征摘要】
1.一种微卫星不稳定的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述引物组中的引物包含检测靶标互补配对区和检测靶标非互补配对区；所述检测靶标非互补配对区位于所述引物的5’端，长度为0～25bp；通过调整所述引物组中各引物所述检测靶标非互补配对区的长度，使得各引物的目的扩增产物之间长度差异至少为15bp。


2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组中的引物无荧光标记修饰。


3.根据权利要求1或2所述的引物组，其特征在于，当所述扩增产物的长度为80～200bp时，所述引物组包含的用于微卫星位点扩增的引物对不超过10个。


4.一种微卫星不稳定检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～3任一项所述的引物组。


5.一种肿瘤细胞微卫星不稳定的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述引物组包括分别用于扩增微卫星位点BAT25、NR24、MONO27、BAT26和NR21的引物对，序列如SEQIDNO.1-10所示。


6.根据权利要求5所述的肿瘤细胞微卫星不稳定的多重PCR检测引物组，其特征在于，所述引物组还包括用于扩增微卫星位点NR27的引物对，所述引物对的序列如SEQIDNO.11-12所示。

【专利技术属性】
技术研发人员：万华，刘运超，方楠，张东兴，伍启熹，王建伟，刘倩，唐宇，
申请(专利权)人：北京优迅医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11