通过聚合酶链式反应直接在原始样品中检测目标DNA并通过高分辨熔解分析进行基因分型的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过聚合酶链反应（PCR）直接在原始样品中检测目标DNA并通过高分辨率熔解（HRM）分析进行基因分型的方法。该方法包含稀释原始样品、通过先升高后降低的温度梯度处理稀释的原始样品、进行PCR扩增、然后进行HRM分析。该方法还包含监测在HRM分析过程中由于释放嵌入分子或化合物的释放，温度诱导的双链扩增子变性为两个单链DNA而产生的信号发射变化。通过读取器分析信号变化，通过连接至读取器的图形界面获得分析结果，从而对原始样品中的目标DNA进行检测。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过聚合酶链式反应直接在原始样品中检测目标DNA并通过高分辨熔解分析进行基因分型的方法
本公开的实施方式涉及通过PCR直接在原始样品中检测目标DNA并通过HRM分析进行基因分型的方法。特别地，本公开的实施方式描述了用于检测导致性传播疾病的几种病原体（例如但不限于HR-HPV（高风险人乳头瘤病毒））的方法。更详细地，本公开允许在一个多重测定中，直接从原始生物样品（包括例如阴道或宫颈粘液）中检测病原体DNA，而无需DNA提取步骤。
技术介绍
聚合酶链式反应（PCR）是一种用于全世界诊断应用的可靠技术。PCR由在体外扩增特异性的核酸的引物延伸反应组成。该反应利用热稳定的DNA聚合酶，并且其是基于包括不同温度步骤在内的几个循环，可以进行DNA变性、引物退火和聚合酶介导的目标DNA的延伸。PCR可以与能够嵌入双链DNA的荧光染料或荧光标记的DNA探针结合使用；用这种方法，新合成的扩增子产生的信号可以通过荧光采集被实时采集定量。高分辨率熔解（HRM）是另外的PCR之后的分析步骤，其通过研究双链DNA的热变性进一步表征扩增子。这是通过分析升温范围通常在65℃至95℃内、荧光采集速率为0.1℃/sec或更小的扩增子解离（熔解）行为来实现的。HRM已被用于诊断（例如能够在多态的等位基因中识别SNP的基因检测），并且其已被提议用于包括病原体检测在内的多种应用。如今，HRM分析需要高纯度的提取的DNA：这将其应用主要限制在能够自动提取DNA的高输入量（high-income）环境中。特别地，HRM需要高纯度的提取的DNA，因为DNA制备污染会导致熔解曲线发生不可预测的失真。此外，为了获得高特异性，HRM在需要目标专用引物和探针组的PCR反应中进行，而这些引物和探针组通常不是十分便宜的试剂。尽管如此，HRM对于低输入量（low-income）环境中的有益应用（如人类病原体的表征）仍具有巨大的未开发潜力。事实上，确实需要提供能够被用于将HRM技术直接应用于原始样品中的方法，该方法不需要昂贵且费时的DNA提取步骤，并且无需使用昂贵的引物和探针对。众所周知，HPV是全世界浸润性宫颈癌的必要原因。该肿瘤是女性中最常见的肿瘤之一，全球超过500,000例1，并且其主要由高风险HPV（HR-HPV）基因型的持续感染决定；迄今为止，已发现大约有20种癌症相关HR-HPV，其中HPV16和HPV18最为常见（占所有浸润性宫颈癌的70%）2,3。有效的宫颈癌筛查项目降低了这种肿瘤的发病率和死亡率4；最初的筛查是通过Papanicolau试验（Pap试验）进行的，这是一种能够识别癌前细胞的细胞学试验，通过宫颈内刷收集宫颈标本后在显微镜载玻片上接种和染色后实现。该技术具有很高的阳性预测值，但平均灵敏度差5，且阴性预测值低。此外，使用宫颈内刷可能会带来痛苦和侵害，并且在心理上会限制部分群体进行检查，尤其是在出于社会和宗教原因而很少去妇科就诊的情况下。鉴于HPVDNA试验的阴性预测值较高，目前的研究表明HPVDNA试验在预防浸润性宫颈癌方面比单独进行Pap试验筛查更为有效6-8。此外，鉴于不同的HR-HPV基因型之间癌症发展的阳性预测值的差异，HPV基因分型在宫颈癌和其他HPV相关的癌症（例如，肛门-生殖器的和口咽的肿瘤）中对HPV阳性患者进行分类是有用的9-13。它也可以区分暂时性感染与持续性感染，后者是癌症转化的真正危险因素。最后，基因分型试验可以是群体研究中用于疫苗监测和群体免疫的重要工具，用于评估接种疫苗和未接种疫苗群体中每种基因型的盛行率（prevalence）的变化14。如今，最广泛的试验可以分为两类15：1.信号放大试验，如基于HybridCapture®2（HC2，Qiagen）技术的Digene®HPV测试，以及Cervista®HPVHR试验。HC2是基于13种标记的HR-HPV-特异性的RNA探针组与目标HPVDNA的杂交的一种非放射性的信号放大方法；DNA-RNA杂合物被与碱性磷酸酶偶联的特异性抗体识别并被吸附至微孔底部。通过化学发光信号测量的酶活性与目标DNA的量成正比。Cervista®HPV-HR试验采用基于荧光共振能量转移（FRET）的技术，其中每种HPV类型有两个探针；其能够检测到14种HR-HPV。这些技术是定量的且假阳性率较低，但其不提供任何HPV基因分型的信息，并且其需要专用的仪器。2.核酸扩增试验，基于实时PCR方法；在这些试验中，COBAS4800HPV试验（罗氏公司（Roche）开发）是最广泛的，在全自动系统中采用几个引物对和探针对提供HPV16和HPV18的基因分型信息。该试验（如Qiagen’s）被认为是黄金标准，并且其具有非常高的灵敏度。其他基于PCR的试验包括Papillocheck®（GreinerBio-One），该试验能够通过DNA芯片上的28种探针对24种HPV进行检测和基因分型；PCR后，杂交在自动扫描和分析的微阵列芯片上进行。线性阵列HPV基因分型（Roche）是一种基于PCR的试验，结合反向线点杂交，能够区分37种HPV；但是，该试验十分耗时，而且由于容易交叉杂交，其提供的结果是模棱两可的。CepheidHPV是市场上唯一能够在即用型盒中直接使用PreservCyt样品，然后进行专用PCR循环的试验。所有这些试验需要特殊的仪器，并且对于广泛应用不够便宜，尤其是在发展中国家。PCR多重分析通常是一项棘手的分析，因为其使用了几种导致荧光非特异性扩增信号（例如来自引物二聚体形成的背景）的引物组。荧光标记的探针（例如Taqman探针，LifeTechnologies）能够限制这种情况，与不区分扩增子的嵌入染料相比，其确保更高的特异性。但是，荧光标记的探针更昂贵，影响试验的稳定性，并且分析需要一个以上的荧光检测器。需要改进用于通过PCR检测目标DNA并通过HRM进行基因分型的方法，其克服了本领域中的至少一个缺点。特别地，本公开的一个目的是通过PCR提供直接在原始样品中检测目标DNA并通过HRM分析进行基因分型的方法，同时显著提高PCR性能的稳定性。本公开的另一个目的是提供能够直接使用原始样品（例如阴道和宫颈粘液）工作的方法，从而提供相对于女性群体具有更好依从性的测试。本公开的另一个目的是避免DNA提取，同时显著提高HRM性能的稳定性。
技术实现思路
根据实施方式，本公开提供了一种通过PCR直接在原始样品中检测目标DNA并通过HRM分析进行基因分型的方法。根据一个实施方式，该方法包括：-提供要进行检测分析的原始样品；-使用包含蛋白质消化酶的处理缓冲液稀释所述原始样品，其中所述原始样品被稀释至蛋白质浓度为0.1μg/μl至10μg/μl；-通过先升高后降低的温度梯度来处理稀释的原始样品；-提供一种PCR反应混合物，该PCR反应混合物包含用于两种或更多种目标核酸的多重扩增方法的两对或更多对引物和一种本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过聚合酶链式反应（PCR）直接在原始样品中检测目标DNA并通过高分辨率熔解（HRM）分析进行基因分型的方法，所述方法包含：/n-提供要进行检测分析的原始样品；/n-使用包含蛋白质消化酶的处理缓冲液稀释所述原始样品，其中将所述原始样品稀释至蛋白质浓度为0.1 μg/μl至10 μg/μl；/n-通过先升高后降低的温度梯度来处理稀释的原始样品；/n-提供一种PCR反应混合物，该PCR反应混合物包含用于以多重方式扩增两种或更多种目标核酸的两对或更多对扩增引物和一种扩增缓冲液，所述扩增缓冲液包含并入双链扩增子中并发射可检测信号的嵌入分子或化合物；/n-使用所述PCR反应混合物和所述经处理的稀释的原始样品进行PCR扩增；/n-在PCR扩增结束时，对PCR反应混合物和先前进行PCR扩增的所述经处理的稀释的原始样品进行HRM分析；/n其中所述方法进一步包含在HRM分析过程中监测由于嵌入分子或化合物的释放，温度诱导的双链扩增子变性为两个单链DNA而产生的信号发射变化，/n其中所述方法进一步包含通过读取器分析信号变化并通过连接至所述读取器的图形界面获得分析结果来检测原始样品中的目标DNA。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种通过聚合酶链式反应（PCR）直接在原始样品中检测目标DNA并通过高分辨率熔解（HRM）分析进行基因分型的方法，所述方法包含：
-提供要进行检测分析的原始样品；
-使用包含蛋白质消化酶的处理缓冲液稀释所述原始样品，其中将所述原始样品稀释至蛋白质浓度为0.1μg/μl至10μg/μl；
-通过先升高后降低的温度梯度来处理稀释的原始样品；
-提供一种PCR反应混合物，该PCR反应混合物包含用于以多重方式扩增两种或更多种目标核酸的两对或更多对扩增引物和一种扩增缓冲液，所述扩增缓冲液包含并入双链扩增子中并发射可检测信号的嵌入分子或化合物；
-使用所述PCR反应混合物和所述经处理的稀释的原始样品进行PCR扩增；
-在PCR扩增结束时，对PCR反应混合物和先前进行PCR扩增的所述经处理的稀释的原始样品进行HRM分析；
其中所述方法进一步包含在HRM分析过程中监测由于嵌入分子或化合物的释放，温度诱导的双链扩增子变性为两个单链DNA而产生的信号发射变化，
其中所述方法进一步包含通过读取器分析信号变化并通过连接至所述读取器的图形界面获得分析结果来检测原始样品中的目标DNA。


2.根据权利要求1所述的方法，其中通过先升高后降低的温度梯度来处理稀释的原始样品，包含进行以下温度步骤：
-第一孵育步骤，在25℃至70℃的温度范围内进行5至60分钟，
-第二孵育步骤，在90℃至100℃的温度范围内进行5至60分钟，
-第三孵育步骤，在0℃至10℃的温度范围内进行5至60分钟。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述蛋白质消化酶选自：内切蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和内肽酶。


4.根据权利要求3所述的方法，其中所述蛋白质消化酶是蛋白酶K，并且所述蛋白质消化酶在所述处理缓冲液中的浓度为1mg/mL至1μg/mL。


5.根据权利要求1至4中的任一项所述的方法，其中所述处理缓冲液包含TrisHCl缓冲溶液。


6.根据权利要求5所述的方法，其中所述TrisHCl缓冲溶液的浓度为1M至10mM，并且pH为7.0至10.0。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述处理缓冲液进一步包含水解酶。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述处理缓冲液进一步包含pH稳定剂。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述处理缓冲液进一步包含防腐剂。


10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中PCR反应混合物的扩增缓冲液进一步包含选自以下添加剂中的一种、多种或所有添加剂：NP40、DMSO、TMAC（四甲基氯化铵）、乙酰胺、Triton、甲酰胺、甜菜碱、大肠杆菌ssDNA结合蛋白、甘油、左旋肉碱和明胶。


11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中提供了用于进行PCR反应的容器（15），所述原始样品被包含在所述容器（15）中，其中所述容器（15）的第一区域含有包含所述PCR混合物或扩增缓冲液的第一相（14），所述第一相（14）是固体、半固体或凝胶，其中在所述第一区域上或上方具有所述容器（15）的第二区域，该第二区域含有包含所述处理缓冲液的第二相或上相（16），所述第二相或上相（16）是液体，其中使用所述处理缓冲液稀释所述原始样品以及通过进行温度梯度处理稀释的原始样品都发生在第二区域中，并且PCR反应及然后进行的HRM分析在同一所述容器（15）中的第一区域中进行。


12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中PCR扩增是实时PCR。


13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述PCR扩增在热循环仪或实时PCR热循环仪中进行，其中，当所述PCR扩增在热循环仪中进行时，HRM分析在单独的实时PCR热循环仪中进行，而当所述PCR扩增在实时PCR热循环仪中进行时，HRM分析在同一实时PCR热循环仪中进行。


14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述目标DNA是病原体目标DNA，其中所述病原体是导致性传播疾病或感染的病原体。


15.根据权利要求14所述的方法，其中所述病原体是人乳头...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁迪·伊波迪里诺，布鲁纳·马里尼，爱丽丝·阿维安，马尔科·莫塞尼戈，尼古拉·福斯基，伊丽莎白·莫罗，
申请(专利权)人：乌利赛生物医学股份公司，
类型：发明
国别省市：意大利;IT