从江香猪IFN-λ1基因的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种从江香猪IFN‑λ1基因的检测方法。本发明专利技术属于核酸检测领域，特别是一种快速检测目的基因的方法。提供一种从江香猪IFN‑λ1基因扩增方法，旨在为后续研究IFN‑λ1的抗病毒活性以及抗病毒类药物研发奠定工作基础。本发明专利技术采用淋巴细胞分离法分离淋巴细胞，并提取细胞总RNA，通过RT‑PCR扩增出目的基因，克隆、测序完成以后对IFN‑λ1基因进行相关遗传进化分析，以探寻IFN‑λ1基因与其他哺乳动物之间的相关性，为进一步研究IFN‑λ1基因的抗病毒活性提供依据。

Detection of IFN - \u03bb 1 gene in Congjiang Xiang pig

【技术实现步骤摘要】
从江香猪IFN-λ1基因的检测方法
本专利技术属于核酸检测领域，特别是一种快速检测目的基因的方法。
技术介绍
λ干扰素(interferon-λ，IFN-λ)是2003年由Sheppard等发现的一种新的III型干扰素，其家族成员包括IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3和IFN-λ4。在细胞中，由于不同IFN-λ基因结构和转录调节因子的差异，IFN-λ1比其他三种IFN-λ的表达要早，因此，IFN-λ1在早期抑制病毒增殖过程中起了重要作用。目前的研究发现，IFN-λ1在抗病毒方面有良好的疗效，如Ilyushina,NataliaA等发现在连续传代的人肺上皮细胞系(Calu-3)中，增加IFN-λ1的表达量会强烈抑制甲型H1N1流感病毒的增殖；中国农业科学院哈尔滨兽医研究所发现猪源III型干扰素IFN-λ1对猪流行性腹泻病毒有较强的抑制作用，因为其作用于肠粘膜上皮细胞，抗病毒作用比之前的Ⅰ型干扰素更具靶向优势，为进一步开发新的抗病毒药物提供了新思路。从江香猪是贵州省地方小型猪种，因其基因高度纯合，并且和人类的基因组高度相似，因此在医学领域有较高的研究价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是：提供一种从江香猪IFN-λ1基因扩增方法，旨在为后续研究IFN-λ1的抗病毒活性以及抗病毒类药物研发奠定工作基础。本专利技术是这样实现的：从江香猪IFN-λ1基因扩增方法，包括以下步骤：(1)确定待测的目标，进行序列的下载比对，设计特异性引物，并在上游下游引物的5’端加入酶切位点；(2)将设计的分子标记引物加入到PCR扩增体系中，混合PCR反应体系，置于PCR仪上，经过一定的循环后，得到扩增反应产物；(3)将PCR反应产物通过琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察结果；所述的引物为：PoIFN-F：5'-CCAAGCTTATGGCTACAGCTTGGATCGTGGTGC-3'，下游引物PoIFN-R：5'-CCCTCGAGTCAGATGTGCAAGTCTCCACTGGTAACAC-3'，下划线处为XhoI、HindIII酶切位点。所述的PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。所述的琼脂糖凝胶电泳检测是应用体积百分比为1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测；1.2％琼脂糖凝胶配制：称量1.2g琼脂糖，加100mL1×TBE缓冲液，加热溶解于250mL锥形瓶中，加入10μLGoldViewⅠ型核酸染色剂摇匀，冷却待用。将得到从江香猪IFN-λ1基因进行克隆、测序以及相关遗传进化分析。还包括对基因的蛋白结构预测、同源性分析。由于采用了以上技术方案，本专利技术采用淋巴细胞分离法分离淋巴细胞，并提取细胞总RNA，通过RT-PCR扩增出目的基因，克隆、测序完成以后对IFN-λ1基因进行相关遗传进化分析，以探寻IFN-λ1基因与其他哺乳动物之间的相关性，为进一步研究IFN-λ1基因的抗病毒活性提供依据。本研究首次成功克隆了从江香猪IFN-λ1基因，序列比对分析发现从江香猪与野猪IFN-λ1基因的相似性最高(为100.0％)，而与拉布拉多白足鼠的相似性最低(72.7％)，这与IFN-λ1基因系统进化树结果相一致，表明亲缘关系越近，其相似性越高。IFN-λ1氨基酸序列分析表明所选的物种完全相同的氨基酸位点为P74，而其他位点有不同程度变异，可能是由于物种差异造成的，这些变异是否对IFN-λ1蛋白功能产生影响有待研究。在从江香猪IFN-λ1二级结构预测中，肽链中的α螺旋和无规则卷曲占了90.05％，构成了该蛋白质二级结构的主要原件，推测这两种空间构象是从江香猪IFN-λ1肽链中构成配体-受体结合的活性部位；而从江香猪IFN-λ1蛋白质三级结构中包含6个α螺旋，与人的IFN-λ1蛋白质三级结构α螺旋数一致。附图说明图1为从江香猪淋巴细胞分离结果；图2为总RNA片段扩增结果；图3为IFN-λ1基因RT-PCR扩增结果；图4为从江香猪IFN-λ1蛋白三级结构预测图；图5为从江香猪IFN-λ1基因同源性分析；图6为从江香猪IFN-λ1遗传进化分析。具体实施方式本专利技术的实施例：从江香猪IFN-λ1基因扩增方法1、淋巴细胞分离取EDTA抗凝管采集从江香猪前腔静脉血液10mL，按照淋巴细胞分离液操作说明进行分离，具体步骤如下：(1)取2支10mL离心管(灭菌)，取EDTA新鲜抗凝血3mL与PBS液(灭菌)按1:1加入离心管，轻轻吹吸，使其充分混匀。另取干净无菌的4支10mL离心管，先加入3mL分离液，再吸取上述混合液3mL沿管壁小心加于分离液之上，设置离心机温度为22℃，以1500r/min离心15min。(2)离心结束后，可看到细胞在离心管中分为四层(第二层为淋巴细胞层或单核细胞层，呈乳白色环状)，用1mL/2.5mL注射器小心吸取第二层转入新的离心管。(3)向步骤(2)中收集的淋巴细胞层的离心管中加入无菌PBS液5mL，反复吹打使其充分混匀后，以1500r/min离心10min，温度为22℃，离心后弃去上清液。(4)以同样方法取3mL无菌PBS液重复洗涤2次，以1500r/min离心10min，温度22℃，弃去上清。(5)弃尽上清后将离心管移到细胞培养室操作，无菌条件下加入6mL含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基和终浓度为100μg/mL青链霉素、20μg/mLConA悬浮细胞，置于37℃含5％CO2培养箱中培养48h，收集淋巴细胞培养物。2、引物设计与合成根据GenBank中登录的猪IFN-λ1基因序列(FJ455508)，利用PrimerPremier5.0软件设计从江香猪IFN-λ1基因CDS区的特异性引物，上游引物PoIFN-F：5'-CCAAGCTTATGGCTACAGCTTGGATCGTGGTGC-3'，下游引物PoIFN-R:5'-CCCTCGAGTCAGATGTGCAAGTCTCCACTGGTAACAC-3'，下划线处为XhoI、HindIII，退火温度为56℃，预期扩增片段大小为576bp。引物由昆明硕擎生物技术有限公司合成。3、猪淋巴细胞总RNA的提取(1)取培养48h的淋巴细胞培养瓶，倒出培养液，用无菌1×PBS缓冲液清洗。(2)向瓶中加入3mL的RNAisoplus裂解液，均匀的晃动培养瓶，以确保裂解液能在瓶底的细胞表面均匀分布。(3)将瓶内裂解液移至1.5mL离心管中，用移液枪反复吹打至裂解液中沉淀不明显为止。(4)在室温下(15～30℃)静置5min。(5)向上述步骤2.3.1中含匀浆裂解液的离心管中加入氯仿200μL，盖紧离心管盖，充分混合均匀，使其管内溶液呈明显的乳白色。并在室温下静置5min。(6)启用冷冻离心机中，设置条件在12000×g、4℃下离心15min，小心取出离心管，可见此时本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从江香猪IFN-λ1基因的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)确定待测的目标，进行序列的下载比对，设计特异性引物，并在上游下游引物的5’端加入酶切位点；(2)将设计的分子标记引物加入到PCR扩增体系中，混合PCR反应体系，置于PCR仪上，经过一定的循环后，得到扩增反应产物；(3)将PCR反应产物通过琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察结果；其中，所述的引物包括上游引物PoIFN-F：5'-CCAAGCTTATGGCTACAGCTTGGATCGTGGTGC-3'，下游引物PoIFN-R：5'-CCCTCGAGTCAGATGTGCAAGTCTCCACTGGTAACAC-3'，下划线处为XhoI、Hind III酶切位点。/n

【技术特征摘要】
1.一种从江香猪IFN-λ1基因的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)确定待测的目标，进行序列的下载比对，设计特异性引物，并在上游下游引物的5’端加入酶切位点；(2)将设计的分子标记引物加入到PCR扩增体系中，混合PCR反应体系，置于PCR仪上，经过一定的循环后，得到扩增反应产物；(3)将PCR反应产物通过琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察结果；其中，所述的引物包括上游引物PoIFN-F：5'-CCAAGCTTATGGCTACAGCTTGGATCGTGGTGC-3'，下游引物PoIFN-R：5'-CCCTCGAGTCAGATGTGCAAGTCTCCACTGGTAACAC-3'，下划线处为XhoI、HindIII酶切位点。

<...

【专利技术属性】
技术研发人员：万彪，嵇辛勤，胡焱，龙丹丹，邓珊珊，黄梦秋，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52