用于诊断阿维利诺角膜营养不良的引物制造技术

本发明专利技术涉及用于诊断阿维利诺角膜营养不良的实时PCR引物对和探针，更特别地涉及这种用于诊断阿维利诺角膜营养不良的实时PCR引物对和探针，其能够准确地诊断BIGH3基因外显子4中突变的存在或不存在，所述突变是阿维利诺角膜营养不良的原因。使用根据本发明专利技术的引物对和探针可以比使用DNA芯片或PCR的传统方法更快速并准确的模式诊断阿维利诺角膜营养不良。

Primers for the diagnosis of Avelino's corneal dystrophy

【技术实现步骤摘要】
用于诊断阿维利诺角膜营养不良的引物本申请是基于申请日为2009年12月1日，优先权日为2009年4月17日，申请号为201510121642.1，专利技术名称为：“用于诊断阿维利诺角膜营养不良的引物”的专利申请的分案申请。
本专利技术涉及用于诊断阿维利诺角膜营养不良(Avellinocornealdystrophy)的实时PCR引物对和探针，更特别地涉及这种用于诊断阿维利诺角膜营养不良的实时PCR引物对和探针，其能够准确地诊断BIGH3基因外显子4中是否存在突变，所述突变是阿维利诺角膜营养不良的原因。技术背景角膜营养不良是常染色体显性遗传疾病，其开始在角膜中间具有模糊症状且逐渐蔓延，最终患者到老年时丧失视力。角膜营养不良包括阿维利诺角膜营养不良、颗粒状角膜营养不良、格子状I型角膜营养不良、里斯-布克乐斯(Reis-bucklers)角膜营养不良等，且由编码白βIG-H3蛋白的基因突变引起。患有阿维利诺角膜营养不良的杂合子患者随着年龄增长似乎出现严重的视力丧失，而纯合子患者从6岁开始似乎完全丧失视力。阿维利诺角膜营养不良是1988年新命名的疾病，从通常称为颗粒状角膜营养不良中划分出来，因为发现它具有分离的症状和遗传基础。同样地，己知它是世界范围内最常见的角膜营养不良，基于遗传分析的韩国1/340至1/1000的患病率(杂合子的情况)表明它是常见的营养不良(Holland，E.J.等，Ophthalmology,99:1564,1992；Kennedy,S.M.等，Br.J.Ophthalmol.,80:489,1996；Dolmetsch,A.M.等，Can.J.Ophthalmol31:29,1996；Afshari,N.A.等，Arch.Ophthalmol,119:16,2001；Stewart,H.S.Hum.Mutat.,14:126,1999)。本专利技术人发现，如果患有杂合阿维利诺角膜营养不良的患者进行准分子激光原位角膜磨削术(LASIK)，两年后，角膜的浑浊度开始明显扩大且最终引起视力丧失(Jun，R.M.等,Opthalmology,111:463,2004)。以前，进行眼科手术期望通过准分子激光原位角膜磨削术或准分子激光手术将使患有角膜营养不良的患者摆脱视力模糊。同样地，即使在韩国，大约己进行30万例准分子激光原位角膜磨削术，其中基于1/1000的患有阿维利诺角膜营养不良的杂合子患者的最低估计，假定有300人丧失视力。经历准分子激光原位角膜磨削术的患者主要在其20岁及30岁进行生产活动。因此，他们的视力丧失导致严重的社会问题和经济问题。此外，美国2000年批准准分子激光原位角膜磨削术后，己发现经历准分子激光原位角膜磨削术的患有阿维利诺角膜营养不良的非洲裔美国患者丧失视力，其推断许多相似的病例可发生在世界各地。因此，尽管为了通过准分子激光原位角膜磨削术预防阿维利诺角膜营养不良的进展，需要准确地诊断阿维利诺角膜营养不良，但仅通过角膜浑浊度的显微观察进行诊断阿维利诺角膜营养不良，因此医生经常遗漏进行准分子激光原位角膜磨削术的患者的潜在症状，其导致视力丧失。因此，快速并准确地诊断角膜营养不良是迫切需要的。己研发了用于检测BIGH3基因突变的DNA芯片，所述突变是阿维利诺角膜营养不良的原因(韩国专利早期公开号10-2007-0076532)。然而，使用所述DNA芯片诊断阿维利诺角膜营养不良不利地需要几个步骤，包括样品中扩增DNA的步骤、使扩增的DNA与DNA芯片杂交的步骤、清洗杂交的DNA芯片的步骤和检测阳性反应的步骤。因此，本专利技术人己进行大量努力以研发能够更有效地诊断阿维利诺角膜营养不良的方法，结果，己发现，如果使用具有序列号1-2核苷酸序列的引物及具有序列号13-14核苷酸序列的探针通过实时PCR方法诊断阿维利诺角膜营养不良，可以比传统方法更快速并准确的方式诊断阿维利诺角膜营养不良，从而完成本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于使用实时PCR方法提供用于更有效并准确地诊断阿维利诺角膜营养不良的引物对和探针。为了实现上述目的，本专利技术提供用于诊断阿维利诺角膜营养不良的实时PCR引物对，其由选自由下列核苷酸序列组成的组的核苷酸序列表示：序列号1-2、序列号3-4、序列号5-6、序列号7-8、序列号9-10、序列号11-12、序列号13-14、序列号15-16、序列号17-18、序列号19-20、序列号21-22及序列号23-24。本专利技术还提供了用于诊断阿维利诺角膜营养不良的实时PCR探针，其由选自由序列号25-42组成的核苷酸序列表示。本专利技术包括以下内容：项1.一种用于诊断阿维利诺角膜营养不良的实时PCR引物对，其由选自由下列核苷酸序列组成的组的核苷酸序列表示：序列号1-2、序列号3-4、序列号5-6、序列号7-8、序列号9-10、序列号11-12、序列号13-14、序列号15-16、序列号17-18、序列号19-20、序列号21-22及序列号23-24；项2.一种用于诊断阿维利诺角膜营养不良的实时PCR探针，其由选自由序列号25-42组成的组中的核苷酸序列表示；项3.根据项2所述的用于诊断阿维利诺角膜营养不良的实时PCR探针，其中所述实时PCR探针用VIC或FAM标记。附图说明图1示出了设计实时PCR引物和探针获得的结果。在图1中，“A”示出了使用最佳引物和探针进行的实时PCR的结果，“B”和“C”示出了使用不同于“A”中的引物进行的实时PCR的结果。图2示出了为了检测引起阿维利诺角膜营养不良的基因突变，使用根据本专利技术的实时PCR引物进行的实时PCR的结果。具体实施方式一方面，本专利技术针对用于诊断阿维利诺角膜营养不良的实时PCR引物对，其由选自由下列核苷酸序列组成的组的核苷酸序列表示：序列号1-2、序列号3-4、序列号5-6、序列号7-8、序列号9-10、序列号11-12、序列号13-14、序列号15-16、序列号17-18、序列号19-20、序列号21-22及序列号23-24。阿维利诺角膜营养不良是由遗传异常引起的疾病，其中BIGH3基因外显子4中的序列CGC突变为CAC从而使位于BIGH3蛋白残基的精氨酸突变为组氨酸(R124H)。当使用本专利技术的引物实施实时PCR方法时，可以比使用DNA芯片的传统方法更快速并准确的方式诊断阿维利诺角膜营养不良。在实时PCR方法中，很难确定温度条件，因为应在相同的温度条件下进行使用引物和探针的实验。特别是，如果只检测一个似阿维利诺角膜营养不良的突变位置，应该在能够使引物和探针结合的温度条件下使用它们。同样地，探针在一定状态下在非常有限的温度范围1℃至3℃的温度下能够结合，在所述状态下检测正常基因的探针和检测突变基因的探针只有一个核苷酸不同。由于这些条件，重要的是找到探针和引物能与目的基因结合的相同温度。特别地，重要的是设计突变探针和正常探针以使其温度在有限范围内可尽量不同。换言之，引物和探针的温度应该本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于诊断阿维利诺角膜营养不良的实时PCR引物对，其由选自由下列核苷酸序列组成的组的核苷酸序列表示：序列号1-2、序列号3-4、序列号5-6、序列号7-8、序列号9-10、序列号11-12、序列号13-14、序列号15-16、序列号17-18、序列号19-20、序列号21-22及序列号23-24。/n

【技术特征摘要】
20090417 KR 10-2009-00335281.一种用于诊断阿维利诺角膜营养不良的实时PCR引物对，其由选自由下列核苷酸序列组成的组的核苷酸序列表示：序列号1-2、序列号3-4、序列号5-6、序列号7-8、序列号9-10、序列号11-12、序列号13-14、序列号15-16、...

【专利技术属性】
技术研发人员：李津，尹正国，
申请(专利权)人：阿维利诺株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国;KR