一种阳离子微泡的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及微泡技术领域，具体为一种阳离子微泡的制备方法，及超声联合阳离子微泡在制备孤独症药物中的应用。本发明专利技术通过先对PEI进行改性，由改性后的PEI与脂质体DSPC和DSPE‑PEG2000制备形成发泡体，发泡体再与由磷酸缓冲盐溶液、甘油和丙二醇按一定配比组成的水合液制成阳离子微泡液，将阳离子微泡液上方的气体置换为全氟丙烷后进行充分震荡即可形成粒径均一、稳定性好、电位适中、黏附能力强的阳离子微泡。超声联合本发明专利技术制备的阳离子微泡能局部、可逆和无创的开放BBB，阳离子微泡黏附BDNF质粒后注入到小鼠、大鼠体内后，超声探头辐照大鼠，可以无创、可逆、重复地开放BBB，增加BDNF在脑内的浓度，达到治疗孤独症大鼠模型的目的。

Preparation and application of a cationic microbubble

【技术实现步骤摘要】
一种阳离子微泡的制备方法及应用
本专利技术涉及微泡
，尤其涉及一种阳离子微泡的制备方法，及超声联合阳离子微泡在制备孤独症药物中的应用。
技术介绍
孤独症(Autism)，又称自闭症、孤独症谱群疾病。以社会交往障碍、言语和非言语发育障碍、兴趣范围狭窄和重复刻板行为为主要特征，孤独症的症状多数始于婴儿期，通常在3岁以前就出现神经精神发育异常，多数伴有不同程度的智力发育落后。自1943年首先报道该病以来，随着对孤独症认识的不断地加深，近年来，世界各地报道的孤独症的发病率逐年上升，有流行病学调查显示，孤独症的患病率约为4/1000，有研究估计，现我国患病人数约有400万-1000万。脑源性神经生长因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)在孤独症患者血清内存在异常。BDNF神经元和BDNF自身直接与孤独症的发病有关，所以BDNF有希望成为孤独症治疗的靶点。然而，由于BDNF分子量较大(12.3kDa)，难以透过血脑屏障(Blood-BrainBarrier,BBB)，所以如何促进BDNF无创的通过BBB，增加BDNF在中枢神系统内的有效药物浓度，将是BDNF治疗孤独症的一个关键科学问题。近年来，低频聚焦超声(Focusedultrasound，FUS)联合微泡(Microbubbles，MB)被证明是一种无创、短暂、可逆、局部地开放BBB的方法，为临床应用有效治疗颅内疾病的药物提供了非常积极的应用价值。微泡的均匀性、稳定性、电位及黏附能力等，对BBB的开放效果有决定性的影响，因此关于微泡的性能及制备方法也成了研究的焦点之一。
技术实现思路
本专利技术针对现有低频聚焦超声联合微泡技术有待进一步深入研究，提供一种有助于提高对BBB开放效果的阳离子微泡的制备方法，以及所述阳离子微泡在制备孤独症的药物中的应用。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案。本专利技术的第一方面，提供一种阳离子微泡的制备方法，包括以下步骤：S1、室温下，硬脂酸与PEI在CDI的催化下反应，制得改性后的聚醚酰亚胺SPEI；所述硬脂酸与PEI的摩尔比为(1.8-2.0):1；所述CDI与PEI的摩尔比为(1.8-2.0):1。优选的，所述PEI的分子量为600Da；所述硬脂酸与PEI的摩尔比为1.8:1；所述CDI与PEI的摩尔比为1.8:1。优选的，步骤S1中，硬脂酸与CDI在氮气保护下混合搅拌1h以上，得预反应液；在氮气保护下，预反应液与PEI在室温下反应，得到悬浊液；悬浊液在冰乙醚的作用下陈化后干燥，得到SPEI。S2、将SPEI、脂质体DSPC和DSPE-PEG2000溶解于氯仿中，得到混合液；所述SPEI与脂质体DSPC的质量比为1:(2.0-2.5)；所述SPEI与DSPE-PEG2000的质量比为1:(0.3-0.4)。优选的，所述SPEI与脂质体DSPC的质量比为1:2.33；所述SPEI与DSPE-PEG2000的质量比为1:0.33。S3、将混合液中的氯仿蒸发完，形成白色产物。S4、向白色产物中加入水合液，使白色产物溶解于水合液中，制得阳离子微泡液；所述白色产物的质量与水合液的体积之比为(0.9-1.1)mg：5mL；所述水合液由磷酸缓冲盐溶液、甘油和丙二醇组成。优选的，所述水合液由磷酸缓冲盐溶液、甘油和丙二醇按体积比8:1:1混合组成。优选的，所述白色产物的质量与水合液的体积之比为1mg：5mL。S5、将阳离子微泡液装于密封容器中，然后将阳离子微泡液上方的气体置换为全氟丙烷。优选的，密封容器内的压强大于或等于密封容器外的压强。S6、震荡密封容器内的阳离子微泡液，形成阳离子微泡。本专利技术的另一方面，提供一种由以上所述制备方法制备的阳离子微泡在制备孤独症药物中的应用。本专利技术的再一方面，提供一种孤独症药物，包括脑源性神经生长因子质粒和以上所述制备方法制备的阳离子微泡。优选的，所述孤独症药物中，脑源性神经生长因子质粒的质量与阳离子微泡的体积之比为5ug：0.5mL。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术通过先对PEI进行改性，由改性后的PEI与脂质体DSPC和DSPE-PEG2000制备形成发泡体，发泡体再与由磷酸缓冲盐溶液、甘油和丙二醇按一定配比组成的水合液制成阳离子微泡液，将阳离子微泡液上方的气体置换为全氟丙烷后进行充分震荡即可形成粒径均一、稳定性好、电位适中、黏附能力强的阳离子微泡。超声联合本专利技术制备的阳离子微泡能局部、可逆、无创的开放BBB，阳离子微泡黏附BDNF质粒后注入到小鼠、大鼠体内后，超声探头辐照大鼠，可以无创、可逆、重复地开放BBB，增加BDNF在脑内的浓度，达到治疗孤独症大鼠模型的目的。附图说明图1为实施例1制备的SPEI600以及PEI600和硬脂酸(Stearic)的氢谱；图2a为实施例1制备的阳离子微泡的结构示意图；图2b为实施例1制备的阳离子微泡的光镜图；图2c为实施例1制备的阳离子微泡的粒径图；图2d为实施例1制备的阳离子微泡不同时间点的粒径与浓度图；图3a为实施例1制备的阳离子微泡注入体外模型B-mode图；图3b为实施例1制备的阳离子微泡注入体外模型B-mode图(半小时)；图4a为小鼠脑内注入CMB前后的B-mode图；图4b为小鼠脑内注入CMB-BDNF质粒前后的B-mode图；图4c为小鼠脑内CMB和CMB-BDNF质粒体内衰减图；图5a为显微镜下荧光阳离子微泡的视图；图5b为荧光显微镜下荧光阳离子微泡的视图；图5c为荧光显微镜下PI染色的BDNF质粒的视图；图5d为荧光显微镜下荧光阳离子微泡与PI染色的BDNF质粒的merge图；图6为实施例1制备的阳离子微泡黏附DNA质粒(大鼠)后的凝胶电泳图；图7为实施例1制备的阳离子微泡与BDNF质粒(大鼠)的黏附效率图；图8为由实施例1新鲜制备的阳离子微泡的电位图；图9a为对照小鼠大脑及CMB开放的小鼠大脑及冠状切片图；图9b为对照小鼠大脑及CMB开放的小鼠大脑荧光成像图；图9c为对照小鼠大脑及CMB开放的小鼠大脑冠状切片荧光成像图；图10a为大鼠开放BBB图；图10b为大鼠的冠状切片图；图10c为大鼠的HE染色图；图10d为大鼠的尼氏染色图；图11a为MOI＝10的细胞转染图；图11b为MOI＝15的细胞转染图；图11c为MOI＝20的细胞转染图；图11d为MOI＝25的细胞转染图；图11e为MOI＝30的细胞转染图；图11f为转染效率图；图12a为大鼠的体重对比图；图12b为大鼠的睁眼活动对比图；图13为大鼠的转身时间的对比图；图14为游泳得分柱状图；图15为刻板行为评分柱状图；图16本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种阳离子微泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、室温下，硬脂酸与PEI在CDI的催化下反应，制得改性后的聚醚酰亚胺SPEI；所述硬脂酸与PEI的摩尔比为(1.8-2.0)∶1；所述CDI与PEI的摩尔比为(1.8-2.0)∶1；/nS2、将SPEI、脂质体DSPC和DSPE-PEG2000溶解于氯仿中，得到混合液；所述SPEI与脂质体DSPC的质量比为1∶(2.0-2.5)；所述SPEI与DSPE-PEG2000的质量比为1∶(0.3-0.4)；/nS3、将混合液中的氯仿蒸发完，形成白色产物；/nS4、向白色产物中加入水合液，使白色产物溶解于水合液中，制得阳离子微泡液；所述白色产物的质量与水合液的体积之比为(0.9-1.1)mg∶5mL；所述水合液由磷酸缓冲盐溶液、甘油和丙二醇组成；/nS5、将阳离子微泡液盛装于密封容器中，然后将阳离子微泡液上方的气体置换为全氟丙烷；/nS6、震荡密封容器内的阳离子微泡液，形成阳离子微泡。/n

【技术特征摘要】
1.一种阳离子微泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、室温下，硬脂酸与PEI在CDI的催化下反应，制得改性后的聚醚酰亚胺SPEI；所述硬脂酸与PEI的摩尔比为(1.8-2.0)∶1；所述CDI与PEI的摩尔比为(1.8-2.0)∶1；
S2、将SPEI、脂质体DSPC和DSPE-PEG2000溶解于氯仿中，得到混合液；所述SPEI与脂质体DSPC的质量比为1∶(2.0-2.5)；所述SPEI与DSPE-PEG2000的质量比为1∶(0.3-0.4)；
S3、将混合液中的氯仿蒸发完，形成白色产物；
S4、向白色产物中加入水合液，使白色产物溶解于水合液中，制得阳离子微泡液；所述白色产物的质量与水合液的体积之比为(0.9-1.1)mg∶5mL；所述水合液由磷酸缓冲盐溶液、甘油和丙二醇组成；
S5、将阳离子微泡液盛装于密封容器中，然后将阳离子微泡液上方的气体置换为全氟丙烷；
S6、震荡密封容器内的阳离子微泡液，形成阳离子微泡。


2.根据权利要求1所述的阳离子微泡的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述PEI的分子量为600Da。


3.根据权利要求2所述的阳离子微泡的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述硬脂酸与PEI的摩尔比为1.8∶1；所述CDI与PEI的摩尔比为1.8...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈圆圆，赵邓超，王峰，陈昕，陈思平，刁现芬，
申请(专利权)人：深圳大学，新乡医学院，
类型：发明
国别省市：广东;44