等位基因核酸富集和检测方法技术

本发明专利技术提供一种富集核酸延伸产物的方法，包括a.对样品中包含一组或多组等位基因对的核酸进行富集，所述富集的产物至少5kb，优选至少8kb，更优选至少10kb，并且富集的产物包含至少一组等位基因对；b.在探针与核酸杂交的条件下将探针与含有核酸的样品接触，所述探针包括分别靶向所述至少一组等位基因对中任一组的两条等位基因的至少两种探针，并且靶向其中一条等位基因的探针的延伸受到抑制，c.延伸探针，和d.富集延伸产物。

Enrichment and detection of allele nucleic acid

【技术实现步骤摘要】
等位基因核酸富集和检测方法
本专利技术属于核酸富集领域，具体涉及利用核酸的杂交和延伸而富集和检测等位基因的方法。
技术介绍
生物单倍体、二倍体和多倍体生物。包括人在内的许多物种都是二倍体生物，即含有两组染色体，单组染色体即为单倍体。在单倍体中，紧密连锁的多个等位基因的线性组合，每种组合方式即为一种单倍型。单倍型可以由多个SNP位点构成，包含丰富的遗传信息，研究单倍型比单个SNP位点具有更好的分析效果，更能有效反映出疾病的遗传机制，其在遗传病检测领域有着越来越广泛的需求。遗传信息的变异是所有基因组的共同特征，而单碱基对的差异，也称单核苷酸多态性(SNP)是变异中最常见的一种形式，占所有已知多态性的90％以上。SNP位点并不是独立遗传的，而是在染色体上成组地遗传。一般来说，一个SNP位点只有两种等位基因，因此又叫双等位基因。单核苷酸多态性是研究人类家族和动植物品系遗传变异的重要依据，因此被广泛用于群体遗传学研究和疾病相关基因的研究，在药物基因组学、诊断学和生物医学研究中起重要作用。基因分型(Phasing)还称为基因定相、单倍体分型或单倍体构建。基因分型是指把二倍体(甚至是多倍体)基因组上的等位基因(包括杂合位点，例如SNP)，按照其亲本正确地定位到父亲或者母亲的染色体上，最终使得所有来自同一个亲本的等位基因都能够排列在同一条染色体里。现有的NGS测序技术，都是把序列打乱混在一起测序。这种方法无法直接区分这些序列中哪一个是父源，哪一个是母源的。通常只能检测出基因组上有哪些变异，以及这些变异的碱基组成(纯合、杂合)，也就是平时所说的基因型。只有经过基因分型，才能够实现这个基因型的区分。基因分型在遗传学研究中应用广泛。例如，人群基因分型后形成的单倍型参考序列集是基因型推断必须的数据材料。而基因型推断是基因型-表型关联分析研究中必不可少的环节。高质量的参考序列集能提升关联分析的统计功效，而对被研究的对象进行基因分型也可以极大地提高基因型推断的准确性。还例如，用多个位点组成的单倍型组，而不是简单的单位点基因型，可实现群体遗传历史的研究。此外，通过基因分型的家系人群单倍型序列，可以计算染色体重组率、重组热点等重要遗传参数。基因分型还可用于探测频发突变、选择信号以及基因表达的顺势调控。SNP作为最常见也是最稳定的一种人类可遗传变异，可靠的SNP分析检测对于疾病的预防与诊断以及实现个性化医疗等均具有重要意义。目前对SNP检测的检测方法有很多。TaqMan探针法针对染色体上的不同SNP位点分别设计PCR引物和TaqMan探针，利用荧光基团和淬灭荧光基团进行实时荧光PCR扩增；SNaPshot法是由美国应用生物公司(ABI)开发的基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，也称小测序；高分辨率熔解曲线分析(HRM)通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，判断是否存在SNP。MassArray法通过引物延伸或切割反应与MALDI-TOF-MS技术相结合，实现基因分型检测；均相无标记的SNP基因分型技术(Hong-QiWang等，AnalyticalChemistry,2011,83,1883-1889)基于连接酶介导的链置换放大技术以及DNA酶催化的化学发光反应；以及基于二代测序的目标区域捕获技术(多重PCR和探针捕获)。这些技术在检测单倍型方面有两个缺陷。第一，绝大部分检测方法都是以DNA为模板进行实验，首先都要从待测样品中提取出DNA，在提取过程中，所有染色体都在同一个反应管内，即两组单倍体是混合在一起的，所以检测结果所能提供的SNP信息来自两组单倍体的总和，也就是说无法判断出哪些基因型来自同一个单倍体，最终无法获得单倍型。第二，受检测平台限制，DNA在检测时都已高度片段化，所以检测结果较难反映出SNP点附近的信息。这些问题因为二代测序较弱的读长能力而无法解决。第三代测序的SMRT技术，依靠其超长的读长能力，虽然可以解决以上两个问题，但受限于第三代测序平台的成本，并不能作为单倍型检测的常规检测手段。现有的HSE(Haplotype-SpecificSeparation)技术可以从物理层面将两个单倍体中的一种分离出来再进行后续的基因型检测，可应用于后续STR分型，法医领域鉴别混合样品等。与HSE技术相仿的RSE(Region-SpecificExtraction)技术则是应用于大片段区域的连续捕获和研究，可应用于高通量测序。HSE利用特异性识别SNP其中一种型的探针，来结合该型所在单倍体的那条DNA序列，聚合酶以探针3’末端为起始，沿着模板序列进行延伸，并参入生物素修饰的碱基，形成含有生物素修饰的DNA序列，最后用链霉亲和素修饰磁珠结合生物素的特性捕获该条DNA序列，达到物理分离的效果。分离的效果取决于起始DNA的质量和探针的特异性，一般在捕获点附近效果最好，离捕获点越远，效果越差。HSE一般能够分离长度约20kb-50kb的DNA片段，远高于常规检测手段所能检测的长度。HSE所依赖的起始DNA质量建立在以下方面。第一是DNA的完整性，即DNA的长度，DNA越长，以DNA为模板的聚合酶才能延伸更长的距离，分离的长度也就更长。第二是DNA断裂的随机性，DNA从原始样品中提取出来的过程中会发生断裂，这个断裂的位置是随机的，最终会造成捕获效果随着距离增加而降低(Dapprichetal.BMCGenomics(2016)17:486)。第三是DNA的总量，人基因组的大小约为3x109bp，而HSE技术一次所能分离的大小约20kb，约占整个基因组的(1/6.67)x10-6，需要投入较高的起始量来保证足够的目标区域的量，所以并不适合处理微量的样品。这些都给HSE技术的实验设计带来了挑战。HSE技术所依赖的探针特异性建立在以下方面。第一是碱基互补配对，即腺嘌呤A一定与胸腺嘧啶T配对，鸟嘌呤G一定与胞嘧啶C配对。然而研究发现，4种碱基之间依然存在着可能错配的情况(Mei-MeiHuang等，NucleicAcidsResearch,Vol.20,No.174567-4573)。第二是聚合酶只能在探针3’末端的碱基完全配对的情况下才能进行延伸。然而，聚合酶在部分错配条件下依然可以进行有效延伸(同上)。第三是探针的长度，分离的成功率随着探针长度的增加会变低，然而较短的探针也会带来非特异性的问题(J.Zander等，ForensicScienceInternational:Genetics29(2017)242-249)。HSE结合二代测序通常会选择WGA(wholegenomeamplification)(Dapprichetal.BMCGenomics(2016)17:486)或者多重PCR。WGA需要较大的数据量，成本更高。多重PCR受限于引物的数量，所检测的SNP位点有限，且只能检测已知突变，不擅长发现低频突变。本领域仍需要高特异性、高通量、快速、低成本的单倍型分离方法。
技术实现思路
本专利技术方法在等位基因检测前对目标区域进行长片段富集，一方面提高本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种富集核酸延伸产物的方法，包括/na.对样品中包含一组或多组等位基因对的核酸进行富集，所述富集的产物至少5kb，优选至少8kb，更优选至少10kb，并且富集的产物包含至少一组等位基因对；/nb.在探针与核酸杂交的条件下将探针与富集的产物接触，所述探针包括分别靶向所述至少一组等位基因对中任一组的两条等位基因的至少两种探针，并且靶向其中一条等位基因的探针的延伸受到抑制；/nc.延伸探针；和/nd.富集延伸产物，/n优选地，步骤a所述富集是引物定向扩增，例如PCR扩增。/n

【技术特征摘要】
1.一种富集核酸延伸产物的方法，包括
a.对样品中包含一组或多组等位基因对的核酸进行富集，所述富集的产物至少5kb，优选至少8kb，更优选至少10kb，并且富集的产物包含至少一组等位基因对；
b.在探针与核酸杂交的条件下将探针与富集的产物接触，所述探针包括分别靶向所述至少一组等位基因对中任一组的两条等位基因的至少两种探针，并且靶向其中一条等位基因的探针的延伸受到抑制；
c.延伸探针；和
d.富集延伸产物，
优选地，步骤a所述富集是引物定向扩增，例如PCR扩增。


2.如权利要求1所述的方法，其中，靶向等位基因对中一条等位基因的探针包含能抑制该探针延伸的修饰，优选地，所述修饰为碱基的双脱氧修饰，优选地，碱基的双脱氧修饰位于探针的3’末端。


3.如权利要求1所述的方法，其中，核酸包含多组等位基因对，并且多组等位基因对中的每一组中，靶向一条等位基因的探针的延伸受到抑制。


4.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法具有选自以下的一个或多个特征：
等位基因对是SNP对，
探针与扩增产物的结合位点靠近扩增产物的任一末端；优选地，探针与扩增产物的结合位点与扩增产物的任一末端的距离小于扩增产物长度的30％-5％，
所述引物设计为使得所述探针与扩增产物的结合位点靠近扩增产物的任一末端。


5.一种单倍型分离方法，包括：
a.对样品中包含一组或多组等位基因对的核酸进行富集，所述富集的产物至少5kb，优选至少8kb，更优选至少10kb，并且富集的产物包含至少一组等位基因对；
b.在探针与核酸杂交的条件下将探针与富集的产物接触，所述探针包括分别靶向所述至少一组等位基因对中任一组的两条等位基因的至少两种探针，并且靶向其中一条等位基因的探针的延伸受到抑制；
c.延伸探针；和
d.富集延伸产物，
优选地，步骤a所述富集是引物定向扩增，例如PCR扩增。


6.如权利要求5所述的方法，其中，靶向其中一条等位基因的探针包含能抑制...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨敬敏，徐辉，卢大儒，王梁辉，唐嘉婕，
申请(专利权)人：上海韦翰斯生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31