一种基因甲基化的检测方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种基因甲基化检测方法，通过用限制性内切酶BstUI消化含有目标基因的待测样品，然后对酶切产物进行PCR扩增，根据PCR扩增结果判断目标基因的甲基化情况。本发明专利技术方法通过对PCR引物的独特设计，大大提升了基因甲基化检测的灵敏度和特异性。

A detection method and application of gene methylation

【技术实现步骤摘要】
一种基因甲基化的检测方法和应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种基因甲基化的检测方法和应用。
技术介绍
DNA甲基化是指在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。因此，研究基因的甲基化对癌症的早期筛查具有非常重要的意义。以结直肠癌为例，研究表明，结直肠癌的发生过程中伴随着众多抑癌基因启动子CpG岛区域的甲基化，这为我们开发新的结直肠癌筛查技术提供了理论基础。FDA已经于2014年批准产品Cologuard用于结直肠癌筛查，其检测标志物包含BMP3和NDRG4基因甲基化，该产品主要面向北美地区的人群。在我国，血浆游离DNA中Septin9基因甲基化检测以及粪便DNA中SDC2基因甲基化检测用于结直肠癌辅助诊断的两个产品已经获批上市，这有助于进行大范围的开展结直肠癌的早诊早筛工作。虽然基因甲基化检测的产品已经获批用于临床，但是目前的产品普遍存在检测标志物单一、方法为传统的亚硫酸盐转化及荧光定量PCR检测，因此其灵敏度和特异性还有待提升。传统的亚硫酸盐转化是利用亚硫酸盐将核酸中未甲基化的胞嘧啶(C)转化为脲嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶则保持不变，转化后甲基化的CpG岛和未甲基化CpG岛就存在明显的序列差异性，通过设计甲基化特异性引物进行荧光定量PCR就可以检测样本核酸中是否存在目标基因甲基化，该方法具有极高的特异性。但是，亚硫酸盐转化会造成DNA严重碎片化，且纯化后会造成大量的DNA损失，因此会极大的影响检测灵敏度，造成假阴性检测结果。此外，血浆游离DNA来自于人体周身且浓度极低,来源于肠道肿瘤细胞的DNA更微量且具有极大的个体差异性；粪便核酸主要为肠道菌群DNA，其包含的人源性DNA来自于整个消化道脱落细胞及其降解释放的DNA，所占比例仅为全部DNA的1％不到，来源于肿瘤细胞的DNA所占比例就更低了。因此，如何高效利用本就微量的样本DNA进行检测达到提升灵敏度的目的就尤为重要了。
技术实现思路
针对现有技术中所存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种区别于传统的亚硫酸盐转化的方法，结合独特的引物设计进行荧光定量PCR进行检测，大大提升了基因甲基化的检测灵敏度。本专利技术所采取的技术方案是：一种基因甲基化检测方法，包括以下步骤：(1)用限制性内切酶BstUI消化含有目标基因的待测样品，得到酶切产物；(2)步骤(1)得到的酶切产物进行PCR扩增，PCR扩增引物组包括目标基因引物组，目标基因引物组的上游引物和/或下游引物的3’末端为“CGC”、“CGCG”或“CGCG”及其之后模板序列的1到2个碱基，优选为“CGC”；此外，引物序列所包含的“CGCG”位点个数可根据具体模板序列进行选择，优选的包含“CGCG”位点数越多，其特异性越高，但需考虑引物的GC比例；(3)根据PCR扩增结果判断目标基因的甲基化情况。优选地，目标基因引物组的扩增子包含至少一个“CGCG”位点。上下游引物之间“CGCG”位点的数目可根据目标序列进行选择，优选的扩增区域覆盖的“CGCG”位点数越多扩增特异性越高。进一步优选地，所述PCR扩增引物组还包括内标基因引物组，所述内标基因引物组及其扩增子不包含“CGCG”位点。以上检测方法中，所述目标基因包括SFRP2、NDRG4、SDC2基因中的至少一种，优选为SFRP2、NDRG4、SDC2联合检测；所述内标基因包括ACTB基因或其他合适的管家基因或拷贝数稳定的保守基因序列中的至少一种，例如GAPDH基因、α-tublin基因，优选为ACTB基因。进一步优选地，所述PCR扩增反应体系中加入GC增强剂，所述GC增强剂包括四甲基氯化铵20-50mM，优选为35mM，和甘油6％-15％(v/v)，优选为8％。一种基因甲基化检测试剂盒，其包括：限制性内切酶BstUI，目标基因扩增引物，所述目标基因扩增引物组的上游引物和/或下游引物的3’末端为“CGC”、“CGCG”或“CGCG”及其之后模板序列的1到2个碱基，优选为“CGC”；此外，引物序列所包含的“CGCG”位点个数可根据具体模板序列进行选择，优选的包含“CGCG”位点数越多，其特异性越高,但需考虑引物的GC比例。优选地，目标基因引物组的扩增子包含至少一个“CGCG”位点。上下游引物之间“CGCG”位点的数目可根据目标序列进行选择，优选的扩增区域覆盖的“CGCG”位点数越多扩增特异性越高。进一步优选地，所述试剂盒还包括内标基因引物组，所述内标基因引物组及其扩增子不包含“CGCG”位点。进一步优选地，所述试剂盒中还包括GC增强剂，所述GC增强剂包括四甲基氯化铵20-50mM，优选为35mM，和甘油6％-15％(v/v)，优选为8％。进一步优选地，所述目标基因包括SFRP2、NDRG4、SDC2基因中的至少一种，优选为SFRP2、NDRG4、SDC2联合检测；所述内标基因包括ACTB基因或其他合适的管家基因或拷贝数稳定的保守基因序列中的至少一种，例如GAPDH基因、α-tublin基因，优选为ACTB基因。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术方法通过将PCR引物的3’末端设计为“CGC”、“CGCG”或“CGCG”及其之后模板序列的1到2个碱基，大大提升了基因甲基化检测的灵敏度和特异性。2、本专利技术方法操作简便，酶切后可直接用于PCR检测，无需对酶切产物进行纯化回收，能有效提升核酸样本的利用率，从而提升检测灵敏度。整个检测过程只需2.5小时，相对于传统的亚硫酸盐转化法很大程度地简化了检测流程，提升了检测效率。3、本专利技术方法可以以粪便DNA作为检测样本，可居家采样、完全无创，具有极高的私密性，能够提升受检者的接受程度。附图说明图1为本专利技术方法的检测原理图。图2为内标基因ACTB检测曲线图。图3为SFRP2基因检测曲线图。图4为NDRG4基因检测曲线图。图5为SDC2基因检测曲线图。具体实施方式下面结合实施例，对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。以下实施例中所用到的PCR引物及探针设计方案如下：针对目标基因SFRP2、NDRG4和SDC2，内标基因ACTB设计荧光PCR引物和探针。目标基因引物组的上游引物和/或下游引物的3’末端为“CGC”、“CGCG”或“CGCG”及其之后模板序列的1到2个碱基，优选为“CGC”；此外，引物序列所包含的“CGCG”位点个数可根据具体模板序列进行选择，优选的包含“CGCG”位点数越多，其特异性越高，但需考虑引物的GC比例；目标基因引物组的扩增子包含至少一个“CGCG”位本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因甲基化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)用限制性内切酶BstUI消化含有目标基因的待测样品，得到酶切产物；/n(2)步骤(1)得到的酶切产物进行PCR扩增，PCR扩增引物组包括目标基因引物组，目标基因引物组的上游引物和/或下游引物的3’末端为“CGC”、“CGCG”或“CGCG”及其之后模板序列的1到2个碱基；/n(3)根据PCR扩增结果判断目标基因的甲基化情况。/n

【技术特征摘要】
1.一种基因甲基化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用限制性内切酶BstUI消化含有目标基因的待测样品，得到酶切产物；
(2)步骤(1)得到的酶切产物进行PCR扩增，PCR扩增引物组包括目标基因引物组，目标基因引物组的上游引物和/或下游引物的3’末端为“CGC”、“CGCG”或“CGCG”及其之后模板序列的1到2个碱基；
(3)根据PCR扩增结果判断目标基因的甲基化情况。


2.根据权利要求1所述的基因甲基化检测方法，其特征在于，目标基因引物组的扩增子包含至少一个“CGCG”位点。


3.根据权利要求1所述的基因甲基化检测方法，其特征在于，所述PCR扩增引物组还包括内标基因引物组，所述内标基因引物组及其扩增子不包含“CGCG”位点。


4.根据权利要求1-3任一项所述的基因甲基化检测方法，其特征在于，所述目标基因包括SFRP2、NDRG4、SDC2基因中的至少一种；所述内标基因包括ACTB基因或其他合适的管家基因或拷贝数稳定的保守基因序列中的至少一种。


5.根据权利要求1-3任一项所述的基因甲基化检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应体...

【专利技术属性】
技术研发人员：高堂杰，王益民，周巧，曹叶，何庆，
申请(专利权)人：人和未来生物科技长沙有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43