一种龙葵曲顶病毒侵染性克隆的构建方法技术

本发明专利技术提供了一种龙葵曲顶病毒侵染性克隆的构建方法，分别设计引物P1与P2，P3与P4，以pLB‑NCTV作为模板，PCR扩增NCTV的第一拷贝片段和NCTV的第二拷贝片段；设计引物P5与P6，以pCB301载体为模板，进行PCR，其产物作为NCTV侵染性克隆的载体骨架；采用多片段同源重组技术将第一和第二拷贝片段构建到所述载体骨架上，获得包含NCTV两个拷贝片段的侵染性克隆；本发明专利技术建立了龙葵曲顶病毒侵染性克隆构建体系，保证了病毒序列高保真度，致病性高，病毒侵染性克隆构建的成功率高，侵染效率高，同时还提供了龙葵曲顶病毒冻干阳性样品，对龙葵曲顶病毒的进一步研究具有重要意义。

A construction method of infective clone of Solanum nigrum kojid virus

【技术实现步骤摘要】
一种龙葵曲顶病毒侵染性克隆的构建方法
本专利技术涉及微生物工程
，具体而言，涉及一种龙葵曲顶病毒侵染性克隆的构建方法。
技术介绍
龙葵是我国传统中药材，历史悠久。近年来由于其药用成分具有显著的抗肿瘤功效，龙葵逐渐引起国内外专家学者的高度重视。近期发现一种龙葵病害普遍发生，呈爆发趋势，感病植株呈现症状植株矮小、叶片扭曲、果实萎缩的症状，严重影响龙葵采收，防治形势不容乐观。龙葵曲顶病毒自然条件下可大规模侵染茄科龙葵，表明该病毒具有入侵番茄、茄子、马铃薯、烟草等茄科作物的风险，但其传毒介体和寄主范围仍不清楚，需尽快明确。此外田间调查显示，浙江省某些地块的龙葵NCTV感染率高达70％；感病龙葵呈现植株矮小、新叶皱缩、果实凋零等症状，严重影响龙葵采收。一旦该病毒病蔓延到我国龙葵种植产区，将会对当地的龙葵产业带来较大影响。因此明确建立龙葵曲顶病毒快速检测手段符合我国龙葵产业的发展需求。然而，目前产业上，我国暂无龙葵病毒病害发生报道。经文献查阅，未有发现龙葵曲顶病毒相关研究，缺乏龙葵曲顶病毒反向遗传学操作体系构建的报道；病毒检测上，也缺本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种龙葵曲顶病毒侵染性克隆的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)提取染病龙葵组织总DNA，设计特异性病毒全长基因组扩增引物，进行病毒序列扩增，回收扩增产物，构建pLB-NCTV，转化，测序，获得龙葵曲顶病毒全基因组序列，如SEQ NO:11所示；/n(2)分别设计引物P1与P2，P3与P4，以pLB-NCTV作为模板，PCR扩增NCTV的第一拷贝片段和NCTV的第二拷贝片段；设计引物P5与P6，以pCB301载体为模板，进行PCR，其产物作为NCTV侵染性克隆的载体骨架；所述载体骨架、第一拷贝片段、第二拷贝片段彼此之间含有15bp的同源序列；/n(3)采用多片段同源重组技术将第一...

【技术特征摘要】
1.一种龙葵曲顶病毒侵染性克隆的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取染病龙葵组织总DNA，设计特异性病毒全长基因组扩增引物，进行病毒序列扩增，回收扩增产物，构建pLB-NCTV，转化，测序，获得龙葵曲顶病毒全基因组序列，如SEQNO:11所示；
(2)分别设计引物P1与P2，P3与P4，以pLB-NCTV作为模板，PCR扩增NCTV的第一拷贝片段和NCTV的第二拷贝片段；设计引物P5与P6，以pCB301载体为模板，进行PCR，其产物作为NCTV侵染性克隆的载体骨架；所述载体骨架、第一拷贝片段、第二拷贝片段彼此之间含有15bp的同源序列；
(3)采用多片段同源重组技术将第一和第二拷贝片段构建到所述载体骨架上，获得包含NCTV两个拷贝片段的侵染性克隆。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物P1-P6序列分别如SEQNO:1-SEQNO:6所示。


3.如权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(4)，将步骤(3)获得的侵染性克隆转化至大肠杆菌中，PCR筛选阳性克隆，提取阳性质粒；步骤(5)，采用电击法将步骤(4)所述阳性质粒转化至EHA105农杆菌感受态中并培养。


4.一种龙葵曲顶病毒侵染性克隆，其特征在于，采用权利要求1-3任一项所述方法构建获得。


5.一种如权利要求4所述龙葵曲顶病毒侵染性克隆的接种方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)挑取农杆菌单斑或农杆菌甘油菌于含相应抗生素的YEP液体培养基中，28℃230rpm振荡培养24～48h；
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张蓬军，孙凯，杨倩倩，俞晓平，许益鹏，郝培应，
申请(专利权)人：中国计量大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33