一种基于胰腺脱细胞支架的胰腺癌体外3D模型的构建方法技术

一种基于胰腺脱细胞支架的胰腺癌体外3D模型的构建方法，属于组织工程及肿瘤侵袭、转移及耐药技术领域；一种基于胰腺脱细胞支架模拟肿瘤在体微环境，经再种植胰腺癌细胞，构建胰腺癌体外3D培养模型。在传统2D培养基于细胞‑细胞相互作用的基础上，引入了细胞‑细胞外基质以及三维空间结构，肿瘤细胞可在其中呈三维立体结构生长，表现为圆形及卵圆形的细胞形态，并可见核质比及核分裂像的改变。该模型的构建包括下列步骤：⑴胰腺组织获取；⑵经水合脱细胞法处理并评价脱细胞效果；⑶钴—60辐照灭菌；⑷胰腺癌细胞再种植及功能评价。

A 3D model of pancreatic cancer in vitro based on acellular scaffold

【技术实现步骤摘要】
一种基于胰腺脱细胞支架的胰腺癌体外3D模型的构建方法
本专利技术属于组织工程及肿瘤侵袭、转移及耐药
，具体是涉及一种基于胰腺脱细胞支架的胰腺癌体外3D模型的构建方法。
技术介绍
胰腺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤，近年来发病率有所升高，其恶性程度高，据最新报道显示，胰腺癌患者五年生存率不超过9％。多数患者发现时已属晚期，肿瘤完整切除率较低，总体预后较差，故胰腺癌的研究仍有重大的临床价值。过去，对于肿瘤细胞特性、侵袭性及耐药性等研究通常建立在体外肿瘤细胞2D培养和肿瘤异种移植模型的基础上，然而，由于缺乏适当的细胞-细胞和细胞-细胞外基质相互作用的三维(3D)结构，2D肿瘤细胞培养模型不能提供适当的肿瘤微环境。肿瘤异种移植模型可以模拟人体肿瘤微环境，然而，动物实验包括了许多不可控因素，包括血流动力学、宿主细胞、内源性生长因子和免疫应答等。此外，监测肿瘤异种移植模型的治疗反应是昂贵和困难的。近年来通过基因修饰的技术方法，将人相关基因直接替换小鼠相关基因建立人源化小鼠模型的方式已被广泛应用于人基因功能研究、肿瘤免疫药物研发、感染性疾病建立以及药物临床前评估等生物医药领域研究，但具有操作复杂，价格昂贵，实验条件要求较高等缺点，仍不能广泛用于胰腺癌的基础研究。近几年的研究已经清楚地证明细胞在二维或三维培养基中表现不同，因此人们努力开发新的肿瘤模型，尽可能准确地再现肿瘤的自然微环境。3D体外培养模型被用于复制肿瘤特异性的细胞和肿瘤微环境，并为2D单层培养和复杂的体内异种植入方法提供了一个重要的选择。三维培养模型通过提供一个较为可控的模拟肿瘤细胞体内生长、侵袭和转移的肿瘤微环境，在这个环境中生长因子、细胞外基质蛋白和细胞类型等都在人为控制中。在过去的十年中，组织脱细胞(在不影响细胞外基质结构和组成的情况下去除细胞的过程)作为一种替代技术出现在生物医学领域、组织工程和再生医学。心、肺、肝等器官已成功脱细胞，并被细胞重新定植，以期解决终末器官衰竭问题。近几年，组织脱细胞支架也被应用于阐述细胞外基质在肿瘤生长、转移和进展中的复杂作用。脱细胞支架保留了天然组织的生物力学特性和独特的细胞外基质组成和结构，可作为肿瘤工程的平台。本专利技术采用大鼠的正常胰腺组织，这些组织被有效地脱细胞并重新填充了人类胰腺癌细胞，构建了一种具有理想空间排列、生物力学性能和生物相容性的肿瘤三维支架，建立了一个模拟胰腺癌微环境的体外模型。通过本专利技术的叙述及相关实验证明，胰腺脱细胞支架可以作为一种理想的体外胰腺癌工程支架，该模型旨在阐明胰腺脱细胞支架对胰腺癌细胞的作用及其对胰腺癌细胞增殖、侵袭、转移、耐药等生物学特性的影响及相关机制的研究，进一步用于胰腺癌化疗药物筛选及个体化临床化疗方案的制定。
技术实现思路
本专利技术主要是解决上述现有技术所存在的技术问题，提供一种基于胰腺脱细胞支架的胰腺癌体外3D模型的构建方法。本专利技术的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：一种基于胰腺脱细胞支架的胰腺癌体外3D模型的构建方法，所述胰腺脱细胞支架来源于小鼠、大鼠和猪胰腺，所述将胰腺脱细胞支架作为体外肿瘤模型，所述构建方法为：步骤1、胰腺脱细胞支架通过钴—60辐照灭菌，灭菌后在37℃的培养基中孵育5分钟；步骤2、将1×107的胰腺癌细胞数经胰酶消化后加入4ml培养基，充分混匀，经脾动脉分4次缓慢注射，每次1ml，间隔15分钟，在37℃的5％CO2培养箱中静置2小时后进行1ml/min循环灌注，每日更换培养基，循环灌注培养5天，获得基于胰腺脱细胞支架的胰腺癌体外3D模型。作为优选，所述步骤2中胰腺癌细胞系包括HPAC、HuP-T4、BxPC-3、Capan-1、Miapaca-2、PANC-1、HS766T、CFPAC-1、HuP-T3、HPAF-II、KP-4、Panc02.03、Panc03.27、Panc04.03、Panc08.13、QGP-1、YAPC、SU.86.86、PK-59、PSN1、SW1990、T3M-4、Capan-2、Panc10.05。作为优选，所述HPAC的培养基为DMEM+0.002mg/ml胰岛素+0.005mg/ml转铁蛋白+40ng/ml氢化可的松+10ng/ml表皮生长因子+5％FBS，所述HuP-T4的培养基为MEM+20％FBS+1％NEAA+1％NaP，所述BxPC-3和Capan-1的培养基为IMDM+20％FBS，所述Miapaca-2的培养基为DMEM+10％FBS+2.5％horseserum，所述PANC-1和HS766T的培养基为：DMEM+10％FBS，所述CFPAC-1、HuP-T3和HPAF-II的培养基为MEM+10％FBS+1％NEAA+1％NaP，所述KP-4、Panc02.03、Panc03.27、Panc04.03、Panc08.13、QGP-1、YAPC、SU.86.86、PK-59和PSN1的培养基为：RPMI-1640+10％FBS，所述SW1990的培养基为L-15+10％FBS，所述T3M-4的培养基为HamF10+10％FBS，所述Capan-2的培养基为McCoy's5a+10％FBS，所述Panc10.05的培养基为RPMI-1640+10Units/mlhuman+15％FBS。一种使用胰腺癌体外3D模型制备胰腺癌细胞悬液的方法，所述制备方法为：步骤1、对胰腺癌体外3D模型进行胰腺癌细胞定植、细胞形态的观察及增殖的检测，该胰腺癌体外3D模型经石蜡包埋，连续切片，切片脱蜡，HE及Ki67免疫组化染色，封片观察；步骤2、获取胰腺癌细胞，通过胰蛋白酶消化提取，将种植有胰腺癌细胞的胰腺脱细胞支架切成小块，在37℃下用1％胰蛋白酶消化30分钟，并相互摇晃，加入含10％FBS的培养基结束反应，将溶液以300g离心10分钟，通过孔径为70μm的BD-Falcon细胞过滤器过滤含有细胞的溶液，获得单个分离细胞，将获得的细胞重悬，得到3D培养的胰腺癌细胞悬液。作为优选，所述胰腺癌细胞悬液应用于细胞功能学实验、耐药性检测及相关机制研究。本专利技术具有的有益效果：本专利技术公开了一种基于胰腺脱细胞支架模拟肿瘤在体微环境，经再种植胰腺癌细胞，构建胰腺癌体外3D培养模型。在传统2D培养基于细胞-细胞相互作用的基础上，引入了细胞-细胞外基质以及三维空间结构，肿瘤细胞可在其中呈三维立体结构生长，表现为圆形及卵圆形的细胞形态，并可见核质比及核分裂像的改变。该模型的构建包括下列步骤：⑴胰腺组织获取；⑵经水合脱细胞法处理并评价脱细胞效果；⑶钴—60辐照灭菌；⑷胰腺癌细胞再种植及功能评价。胰腺癌细胞的生长、侵袭、转移与其所处的微环境密切相关，脱细胞支架较好的保留了主要细胞外基质、生长因子及空间结构，在模拟体内肿瘤生长微环境上具有显著优势。该模型可为胰腺癌细胞体外研究其增殖、侵袭及耐药等生物学功能的机制研究提供理想的模型，可进一步用于胰腺癌化疗药物筛选及个体化临床化疗方案的制定。附图说明图1是正常大鼠的胰腺组织保留了完整本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于胰腺脱细胞支架的胰腺癌体外3D模型的构建方法，所述胰腺脱细胞支架来源于小鼠、大鼠和猪胰腺，所述将胰腺脱细胞支架作为体外肿瘤模型，其特征在于所述构建方法为：/n步骤1、胰腺脱细胞支架通过钴—60辐照灭菌，灭菌后在37℃的培养基中孵育5分钟；/n步骤2、将1×10

【技术特征摘要】
1.一种基于胰腺脱细胞支架的胰腺癌体外3D模型的构建方法，所述胰腺脱细胞支架来源于小鼠、大鼠和猪胰腺，所述将胰腺脱细胞支架作为体外肿瘤模型，其特征在于所述构建方法为：
步骤1、胰腺脱细胞支架通过钴—60辐照灭菌，灭菌后在37℃的培养基中孵育5分钟；
步骤2、将1×107的胰腺癌细胞数经胰酶消化后加入4ml培养基，充分混匀，经脾动脉分4次缓慢注射，每次1ml，间隔15分钟，在37℃的5％CO2培养箱中静置2小时后进行1ml/min循环灌注，每日更换培养基，循环灌注培养5天，获得基于胰腺脱细胞支架的胰腺癌体外3D模型。


2.根据权利要求1所述的一种基于胰腺脱细胞支架的胰腺癌体外3D模型的构建方法，其特征在于所述步骤2中胰腺癌细胞系包括HPAC、HuP-T4、BxPC-3、Capan-1、Miapaca-2、PANC-1、HS766T、CFPAC-1、HuP-T3、HPAF-II、KP-4、Panc02.03、Panc03.27、Panc04.03、Panc08.13、QGP-1、YAPC、SU.86.86、PK-59、PSN1、SW1990、T3M-4、Capan-2、Panc10.05。


3.根据权利要求2所述的一种基于胰腺脱细胞支架的胰腺癌体外3D模型的构建方法，其特征在于所述HPAC的培养基为DMEM+0.002mg/ml胰岛素+0.005mg/ml转铁蛋白+40ng/ml氢化可的松+10ng/ml表皮生长因子+5％FBS，所述HuP-T4的培养基为MEM+20％FBS+1％NEAA+1％NaP，所述BxPC-3和Capan-1的培养基为IMDM+20％FBS，所述Miapaca-2的培养基为DMEM...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆玉华，葛健康，李晓红，郭益冰，陆晶晶，朱铭岩，王尧，王雷，周鹏成，王志伟，
申请(专利权)人：南通大学附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32