一种新型碱基转换编辑系统及其应用技术方案

本发明专利技术首次创新提出了一种新型碱基转换编辑系统，除了保留单碱基基因编辑系统的功能—即实现指定位点单个碱基C/G到T/A的转换，以及实现A/T到G/C转换，同时也能实现指定位点C/G到T/A、和A/T到G/C的转换，所述新型碱基转换编辑系统包括sgRNA、能够靶向识别DNA序列的核酸酶、胞嘧啶脱氨酶、腺苷脱氨酶、尿嘧啶糖苷酶抑制剂。本发明专利技术还提供包含该新型碱基转换编辑系统的组合物或试剂盒，以及其在基因编辑、胞嘧啶脱氨酶的活性检测、腺苷脱氨酶的活性检测等各方面的应用。本发明专利技术突破了现有技术中只能进行单一类型碱基转换的技术局限，可以实现更大范围的DNA碱基改变，进一步丰富了碱基编辑工具箱。

A new base conversion editing system and its application

【技术实现步骤摘要】
一种新型碱基转换编辑系统及其应用
本专利技术涉及基因编辑
，具体涉及一种新型碱基转换编辑系统及其应用。
技术介绍
基因编辑技术属于一种新的DNA序列定点改造的分子生物学工具，能在一段人工设计的RNA序列引导下，识别特定的配对DNA序列，通过同时具有胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶的作用，将在特定窗口内除了实现单个碱基C/G到T/A的转换，还可以实现A/T到G/C转换，同时也能实现C/G到T/A，A/T到G/C同时转换，形成两种类型碱基的转换，对这一段DNA的蛋白质编码、基因转录调控、非编码RNA的序列进行改造，实现一系列新的生物学功能变化，可以广泛用于DNA改造相关的应用，例如生物材料的改进、动植物的品种改良(基因改造和性状提升)、功能基因筛选等。随着基因编辑技术的崛起，人们开始使用ZFN、TALEN、CRISPR/Cas等技术对各种功能基因进行编辑进行研究。其中ZFN技术是由一种能够靶向特定DNA序列的锌指蛋白组合和TypeII核酸内切酶(如FokI)融合组成的人工重组蛋白。一般情况下，FokI被改造成需要通过二聚体发挥作用，所以需要本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于对基因组突变窗口进行编辑的碱基转换编辑系统或组合物，其特征在于，其包含用于表达含有能够靶向识别DNA序列的核酸酶、胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶的融合蛋白的第一载体或第一核酸构建体，和用于表达sgRNA及尿嘧啶糖苷酶抑制剂的第二载体或第二核酸构建体；/n其中，所述第一载体或第一核酸构建体包括5’-3’的式(I)结构：/nP

【技术特征摘要】
1.用于对基因组突变窗口进行编辑的碱基转换编辑系统或组合物，其特征在于，其包含用于表达含有能够靶向识别DNA序列的核酸酶、胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶的融合蛋白的第一载体或第一核酸构建体，和用于表达sgRNA及尿嘧啶糖苷酶抑制剂的第二载体或第二核酸构建体；
其中，所述第一载体或第一核酸构建体包括5’-3’的式(I)结构：
PII-X1-L1-X2(T1-T2)-L2-X3-PolyA式(I)；
其中，PII为II型启动子；
X1为胞嘧啶脱氨酶的编码序列；
X2为腺嘌呤脱氨酶的编码序列，其包括串联的野生型腺嘌呤脱氨酶T1和突变型腺嘌呤脱氨酶T2；
X3为能够靶向识别DNA序列的核酸酶的编码序列，包括：突变型Cas9核酸酶的编码序列；或以DNA，RNA为向导序列、靶向特定DNA序列的蛋白质及相关系统，包括Cpf1及其同源基因、SaCas9相关同源蛋白；或以蛋白质模块识别DNA的工具系统，包括锌指核酸酶ZFN、转录激活样效应因子TALE；
L1、L2为无或连接序列；以及
所述第二载体或第二核酸构建体包括5’-3’的式(II)结构：
PIII-Y1-PII-Y2-L3-Y3-PolyA式(II)；
其中，PIII为III型启动子；
Y1为sgRNA的骨架序列，该sgRNA是能够与指定靶点序列互补配对的导向RNA；
PII为II型启动子；
Y2为尿嘧啶糖苷酶抑制剂的编码序列；
L3为自剪接多肽，选自T2A、P2A、E2A、F2A之一或其组合；
Y3为筛选标记蛋白表达序列；
上述“-”表示连接键或核苷酸连接序列。


2.如权利要求1所述的碱基转换编辑系统或组合物，其特征在于，所述式(I)中，PII选自CMV启动子、CAG启动子、PGK启动子、EF1α启动子或其组合；X1为来源大鼠胞嘧啶脱氨酶或人胞嘧啶脱氨酶的编码序列；X2为细菌来源的腺嘌呤脱氨酶的编码序列；X3为带有D10A突变的可以实现切割靶向链Cas9核酸酶的编码序列；PolyA为BGH序列或SV40的PolyA序列，或其他PolyA序列。


3.如权利要求1所述的碱基转换编辑系统或组合物，其特征在于，所述式(II)中，PIII为H1启动子、U6启动子或其组合；Y1为spCas9核酸酶的sgRNA的骨架序列，且与式(I)所使用的Cas9核酸内切酶相对应；所述Y2为人源尿嘧啶糖苷酶抑制剂UGI；所述L3是自剪接多肽T2A；所述Y3为绿色荧光蛋白；所述PolyA是BGH序列。


4.如权利要求1～3之任一项所述的碱基转换编辑系统或组合物，其特征在于，其中sgRNA的任意位置含有C且同时5-8位对应于出现A且能与对应的指定位点进行互补配对，从而除了实现指定位点单个碱基C/G到T/A的转换，还可以实现A/T到G/C转换，也能同时实现指定位点C/G到T/A，以及A/T到G/C转换。


5.如权利要求1～3之任一项所述的碱基转换编辑系统或组合物，其特征在于，所述Cas9核酸酶选自来源于酿酒酵母Cas9的突变体spCas9n，或选自能识别其它PAM的Cas9突变体，或选自识别PAM:NNGRRT的黄色葡萄球菌来源的SaCas9n，或选自识别PAM:NNNRRT的黄色葡萄球菌来源SaCas9n突变体，或选自来源于Cas9家族的、能识别TTTNPAM2类的效应蛋白Cpf1，或选自与Cas9功能类似的其他物种中的CRISPR蛋白，以及在此基础上构建的能提高精确性或能识别更广泛PAM的Cas9突变体。


6.如权利要求1～3之任一项所述的碱基转换编辑系统或组合物，其特征在于，其中所述双碱基编辑系统编辑的对象还包括来自真核细胞、细菌、酵母、动物细胞、植物细胞的个体或植株。


7.如权利要求6所述的碱基转换编辑系统或组合物，其特征在于，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：李大力，张晓辉，谢玲，朱碧云，刘明耀，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：上海;31