一种猪NLRP3炎症小体体外模型的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种猪NLRP3炎症小体体外模型的构建方法，包括构建重组质粒pCMV‑N‑MYC‑NLRP3、重组质粒pCMV‑N‑HA‑caspase‑1、重组质粒pCMV‑N‑HA‑ASC、重组质粒pCMV‑N‑MYC‑IL‑1β；将上述4个重组质粒共转染至HEK293T细胞内，经培养，得猪NLRP3炎症小体体外模型。由于HEK293T细胞本身并不表达NLRP3炎症小体的四个组分蛋白(NLRP3、ASC、pro‑caspase‑1、pro‑IL‑1β)，因此体外构建该NLRP3炎症小体的反应平台为后续开展猪相关炎性疾病的研究提供了重要模型。

Construction of an in vitro model of porcine NLRP3 inflammatory corpuscle

【技术实现步骤摘要】
一种猪NLRP3炎症小体体外模型的构建方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种猪NLRP3炎症小体体外模型的构建方法。
技术介绍
NLRP3炎症小体是存在于细胞胞浆内的一种模式识别受体，是由多个蛋白组成的一种大分子蛋白质复合物，能感受机体体内外的各种刺激，活化下游信号通路，从而刺激炎性因子的活化和产生，引起炎症反应。NLRP3炎症小体由NOD样受体的一种——NLRP3(NLRfamily，Pyrindomaincontaining3)蛋白、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosisassociatedspeck-likeproteincontainingaCARDdomain，ASC)以及半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶1前体(pro-caspase-1)三个蛋白组成。其中，ASC作为衔接蛋白，在病原刺激或机体处于危险状态时，其蛋白两端会分别与NLRP3、pro-caspase-1结合形成NLRP3-ASC-pro-caspase-1蛋白复合体，即NLRP3炎症小体，进而使无活性的半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶1前体(pro-caspase-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪NLRP3炎症小体体外模型的构建方法，其特征是包括：/n构建重组质粒pCMV-N-MYC-NLRP3、重组质粒pCMV-N-HA-caspase-1、重组质粒pCMV-N-HA-ASC、重组质粒pCMV-N-MYC-IL-1β；/n将上述4个重组质粒共转染至HEK293T细胞内，经培养，得猪NLRP3炎症小体体外模型。/n

【技术特征摘要】
1.一种猪NLRP3炎症小体体外模型的构建方法，其特征是包括：
构建重组质粒pCMV-N-MYC-NLRP3、重组质粒pCMV-N-HA-caspase-1、重组质粒pCMV-N-HA-ASC、重组质粒pCMV-N-MYC-IL-1β；
将上述4个重组质粒共转染至HEK293T细胞内，经培养，得猪NLRP3炎症小体体外模型。


2.根据权利要求1所述的猪NLRP3炎症小体体外模型的构建方法，其特征是：
将上述4个重组质粒共转染至HEK293T细胞内，转染剂量分别为pCMV-N-MYC-NLRP3：200ng、pCMV-N-HA-ASC：20ng、pCMV-N-HA-caspase-1：100ng、pCMV-N-MYC-IL-1β：800ng；于37℃、5％CO2培养箱内培养，培养时间为(30±2)h，结束培养，得猪NLRP3炎症小体体外模型。


3.根据权利要求1或2所述的猪NLRP3炎症小体体外模型的构建方法，其特征是：
以经LPS刺激的猪肺泡巨噬细胞cDNA为模板，PCR扩增NLRP3、ASC、pro-caspase-1、pro-IL-1β基因的相应片段，经酶切后与相应空载连接，NLRP3和pro-IL-1β连接入pCMV-N-MYC空载、ASC和pro-caspase-1连接入pCMV-N-HA空载，...

【专利技术属性】
技术研发人员：师福山，吕倩，郑梦洁，石玉华，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33