生物样品的数字聚合酶链式反应的微流体系统以及相应方法技术方案

本申请提供了一种用于生物样品的dPCR的微流体系统以及相应的方法。

【技术实现步骤摘要】
生物样品的数字聚合酶链式反应的微流体系统以及相应方法
总体上，本专利技术涉及样品分析
，如化学反应或生物化学反应的测定，并且更具体地涉及生物样品的高通量分析
更详细地，本专利技术涉及一种用于生物样品的数字聚合酶链式反应(dPCR)的微流体系统。进一步详细地，这种系统包括微流体设备，所述微流体设备具有与例如孔或微孔形式的反应区域(通常也称为实施为反应室或反应容器的分区)阵列处于流体连通的流动通道，所述反应区域分别起用于其中提供的至少一种生物样品的化学反应或生物反应的反应位点的作用，并且所述系统可以尽可能快速且尽可能可靠地在微流体设备中实现希望的热循环温度分布。进一步地，本专利技术涉及在这种微流体系统中用于生物样品的dPCR的相应方法。
技术介绍
在用于化学反应或生物化学反应的测定的诊断
中，目标是能够在同一(优选地是一次性的)微流体设备上对一个或多个测试样品进行多种不同测定，从而提供在单个分析过程中使用多种不同试剂独立分析一个或多个测试样品的方法。作为此类测试样品，通常使用生物样品，所述生物样品常由医疗人员从患者取得以用于实验室分析，例如用于确定所取样品中不同成分的浓度水平。因此，术语“样品”和“生物样品”是指可能潜在地含有感兴趣的分析物的一种或多种材料，其中样品可能来源于任何生物源，如生理液，包括血液、唾液、晶状体液、脑脊液、汗液、尿液、粪便、精液、乳汁、腹水、粘液、滑液、腹膜液、羊水、组织、培养细胞等，其中可能特别地怀疑样品含有某种抗原或核酸。已知的化学测定、生物化学测定和/或生物学测定大多数包括将如上所述的生物样品固定在反应位点内，并与经固定的样品材料进行一种或多种反应，随后进行定量和/或定性分析过程。在此，对于许多生物学应用、生物化学应用、诊断应用或治疗应用，必要的是能够准确地确定生物样品中某种物质或化合物(即，感兴趣分析物)的量或浓度。为了能够尽可能准确地实现此目标，本
中多年来已经开发了不同的方法，如广为人知的聚合酶链式反应(PCR)方法，聚合酶链式反应方法使能够对生物样品中的核酸进行体外合成，通过这种体外合成可以明确地复制DNA区段，即一种用于复制或扩增样品中的小DNA或RNA区段的有成本效益的方式。用于扩增DNA或RNA区段的此类方法的开发已经在基因分析以及许多遗传疾病的诊断中、或者还在病毒载量的检测中产生了巨大的益处。通常，利用热学循环(还称为热循环)提供对用于扩增此类DNA或RNA区段的反应室内的样品中反应物的加热和冷却，其中常用包括热循环仪的实验室仪器来实现基于PCR的自动诊断测定程序，其中在PCR实施期间，液体PCR样品必须被反复加热和冷却至不同的温度水平并且必须在不同温度平台保持一定的时间量。例如，在典型PCR实施过程中，通过对步骤循环的一系列重复来扩增特定靶核酸，其中反应混合物中存在的核酸(a)在相对较高温度下变性，例如在高于90℃的变性温度下(通常为约94℃至95℃)，以便分离双链DNA，然后(b)将反应混合物冷却至短寡核苷酸引物结合到单链靶核酸上的温度，例如在约52℃至56℃的退火温度下，使引物在分离的DNA链处结合以便提供模板(退火)，并且之后(c)使用聚合酶例如在约72℃的延伸温度下延伸/延长引物以创造新的DNA链，从而复制原始核酸序列。变性、退火和延伸的重复循环(通常约25至30次重复循环)导致样品中存在的靶核酸量的指数增加。现在，为了能够在热循环期间准确地维持此类温度平台，应该维持反应区上的均匀温度分布，使得可以均匀地加热和冷却所有反应区域，以在含有样品的反应区域之间获得均匀的样品收率。为了进行合格的PCR方法，可以使用用于扩增DNA区段的众所周知的热循环设备(如热学循环仪/热循环仪)，所述热循环设备基本上由用于接收样品的安装件(通常也称为样品回火安装件)和附接至所述安装件的热泵组成，所述热管常以下项的组合的形式设置：用于主动加热和冷却安装件并由此用于主动控制提供给样品的温度的Peltier元件，以及用于与所述Peltier元件热学地耦合以将热量散发掉和例如散发到周围环境中的相应散热器。通常，基本需要是保持使诊断测定执行起来更快、更便宜和更简单，同时实现高精度同时提高常规实验室过程的效率。所提及的用于扩增DNA或RNA区段的方法的一个特定例子(本专利技术的焦点)是数字聚合酶链式反应方法(也称为数字PCR或dPCR)，所述数字聚合酶链式反应方法表示对如上所述常规PCR方法的生物技术细化，并且所述数字聚合酶链式反应方法可以用于直接量化和无性地扩增核酸，包括DNA、cDNA或RNA。在此，dPCR与传统PCR之间的实质差异基本上在于测量核酸量的方法，因为传统的PCR每单个样品进行一次反应，而dPCR在被分离到设置在相应大量反应区域内的大量分区中的样品中进行单一反应，其中反应在各反应区域中单独进行，使得更可靠地收集和更灵敏地测量核酸量成为可能。因此，为了实现各种测定操作的小型化和整合已经进行了大量努力，以增加单个载体设备上平行测定的数量。作为这种单个载体设备的例子，已经开发了如微流体芯片等微流体设备，所述微流体设备提供微型通道和微型反应区域来接收可流动样品液(如水性样品液)形式的微升规模样品或纳升规模样品。典型地预先填充到小孔(即，作为反应区域设置在微流体芯片上的微孔或纳米孔)阵列中的微升规模试剂被置于其中是为了接触流动通过流动通道的样品液流，其中每种类型的测定取决于装载到反应区域阵列中的试剂以及流动通道和检测器的配置，其中可以通过将样品液吸移到芯片中来实施将样品液填充到微流体芯片中。此先进技术允许以小型化规模同时进行多种测定。这些化学测定、生物化学测定和/或生物学测定中大多数涉及将生物材料(如多肽和核酸、细胞或组织)固定在孔中，以及与已固定的材料进行一种或多种反应的表现，随后进行如发光测试测量等定量和/或定性分析过程。出于说明的目的，图3A以示意性方式示出了已知微流体芯片6的例子的俯视图，并且图3B以沿图3A中的线A-A的截面视图示出了图3A的芯片6。微流体芯片6由下板61和上板62组成，即所谓的双层微流体芯片，其中上板62提供用于将液体引入芯片的入口63和用于液体从芯片离开的出口64，并且下板61(即芯片的下层)与上板62(即芯片的上层)的组合在其之间建立了流动通道65，所述流动通道65将入口63连接到出口64，其中在所述流动通道65内的上侧(即在上板62的内侧)设置有微孔阵列66。在此，当通过入口53向流动通道65中朝向出口63填充样品液时，当使样品液沿着微孔阵列流动时，样品液被填充到微孔阵列62的每个构件中。然而，当实际上使反应室体积小型化以变成微流体设备的微流体结构从而产生希望的小尺寸时，增加了几个已知的问题，如与以下项有关的问题：增加的表面体积比、或不希望的样品液蒸发、以及特别是在微流体设备中提供的或流动通过微流体设备的液体内不希望的生成气泡。作为本专利技术的焦点，微流体结构内液体中存在的气泡可能构成严重的问题，因为循环通过微流体系统的气泡可能——从侧面来说——不仅损害其中使用的任何种类传感器的微流体结构，而且主要还可能由于造成相邻微孔中样品的不希望的混合而损坏感兴本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于生物样品的数字聚合酶链式反应dPCR的微流体系统(1；1’)，所述微流体系统(1；1')包括：/n至少一个微流体设备(2)，所述微流体设备具有入口(23)、出口(24)、将所述入口(23)连接到所述出口(24)的流动通道(25)、以及与所述流动通道(25)处于流体连通的反应区域阵列(26)；/n流动回路(3)，所述流动回路可连接到所述微流体设备(2)，用于使液体流动通过所述微流体设备(2)的所述流动通道(25)；/n样品液源，所述样品液源可连接到所述微流体设备(2)，用于为所述微流体设备(2)提供样品液(27)；/n主密封液源，所述主密封液源可连接到所述微流体设备(2)，用于为所述微流体设备(2)提供初始密封液(28)以将所述样品液(27)密封在所述反应区域阵列(26)内部；/n次密封液源(4)，所述次密封液源可连接到所述微流体设备(2)，用于为所述微流体设备(2)提供附加密封液(29)；以及/n泵送装置(31)，所述泵送装置连接到所述流动回路(3)并且被适配成将所述附加密封液(29)泵送通过所述流动通道(25)。/n

【技术特征摘要】
20180817 EP 18189498.11.一种用于生物样品的数字聚合酶链式反应dPCR的微流体系统(1；1’)，所述微流体系统(1；1')包括：
至少一个微流体设备(2)，所述微流体设备具有入口(23)、出口(24)、将所述入口(23)连接到所述出口(24)的流动通道(25)、以及与所述流动通道(25)处于流体连通的反应区域阵列(26)；
流动回路(3)，所述流动回路可连接到所述微流体设备(2)，用于使液体流动通过所述微流体设备(2)的所述流动通道(25)；
样品液源，所述样品液源可连接到所述微流体设备(2)，用于为所述微流体设备(2)提供样品液(27)；
主密封液源，所述主密封液源可连接到所述微流体设备(2)，用于为所述微流体设备(2)提供初始密封液(28)以将所述样品液(27)密封在所述反应区域阵列(26)内部；
次密封液源(4)，所述次密封液源可连接到所述微流体设备(2)，用于为所述微流体设备(2)提供附加密封液(29)；以及
泵送装置(31)，所述泵送装置连接到所述流动回路(3)并且被适配成将所述附加密封液(29)泵送通过所述流动通道(25)。


2.权利要求1的微流体系统(1；1')，其中任何密封液(28，29)都是不混溶的液体，优选地，其中任何密封液(28，29)是油和如硅酮液等聚合物液中的一种或其混合物，进一步优选地，其中所述初始密封液(28)和所述附加密封液(29)由相同的密封液材料组成。


3.权利要求1或2的微流体系统(1；1')，其中所述主密封液源和所述次密封液源(4)由不同的密封液储器或由公共密封液储器实施，优选地，其中所述初始密封液(28)是未回火密封液。


4.前述权利要求中任一项的微流体系统(1；1')，其中所述泵送装置(31)由控制单元控制以根据需要将所述附加密封液(29)泵送通过所述流动通道(25)，以便将气泡冲洗出所述流动通道(25)，优选地，其中所述泵送装置(31)被控制成将预定量的所述附加密封液(29)泵送通过所述流动通道(25)，进一步优选地，其中所述泵送装置(31)被控制成不断地、间歇地、或在检测到所述流动通道(25)中的气泡时将所述附加密封液(29)泵送通过所述流动通道(25)。


5.前述权利要求中任一项的微流体系统(1；1')，其中所述微流体系统(1；1')还包括连接到所述流动回路(3)的气泡阱(32)，用于将气体与密封液(28，29)分离，所述气泡阱(32)安排在所述微流体设备(2)的所述出口(24)下游。


6.前述权利要求中任一项的微流体系统(1；1')，其中
所述微流体系统(1；1')用于对以所述样品液(27)形式提供到所述反应区域阵列(26)的每个构件的所述生物样品进行测定；和/或
以连接端口的形式实施所述入口(23)和/或所述出口(24)，用于将所述微流体设备(2)与所述样品液源连接，用于将所述微流体设备(2)与所述主密封液源连接，和/或用于将所述微流体设备(2)与所述次密封液源(4)连接；和/或
所述微流体设备(2)至少由底层(21)和顶层(22)构成，其中所述底层(21)或所述顶层(22)提供所述反应区域阵列(26)、所述入口(23)和所述出口(24)，并且其中所述流动通道(25)建立在所述底层(21)与所述顶层(22)之间，并与所述反应区域阵列(26)处于流体连接，优选地，其中每个反应区域是微孔或纳米孔，进一步优选地，其中所述微流体设备(2)是微流体芯片；和/或
所述样品液(27)是包含所述生物样品和dPCR测定所需试剂的水溶液，优选地，其中首先使所述样品液(27)流动通过所述流动通道(25)进入所述反应区域阵列(26)，并且其中在将所述样品液(27)提供到所述反应区域阵列(26)之后，使所述初始密封液(28)流动进入所述微流体设备(2)的所述流动通道(25)。


7.前述权利要求中任一项的微流体系统(1；1')，其中所述微流体系统(1；1')还包括用于检测所述微流体设备(2)中气泡的存在或生成的检测装置，优选地，其中所述检测装置是光学成像设备，进一步优选地是光学相机。


8.前述权利要求中任一项的微流体系统(1；1')，其中所述微流体系统(1；1')还包括接收所述微流体设备(2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·斯坦纳特，M·齐德，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH