一种芸薹根肿菌DNA提取方法技术

本发明专利技术提供一种芸薹根肿菌DNA提取方法，包括以下操作步骤：(1)将消毒后的根瘤放入抗生素的混合水溶液中浸泡处理20‑30小时，将根瘤中的游动孢子变成休眠孢子，用无菌水冲洗处理后的根瘤；(2)采用40‑60％的蔗糖水溶液悬浮法提取根肿菌休眠孢子；(3)将提取的根肿菌休眠孢子加液氮充分研磨后，放入预冷好的离心管中，加入尿素提取液，提取后，将提取到的芸薹根肿菌DNA加入TE缓冲液溶中保存。本发明专利技术提供的芸薹根肿菌DNA提取方法耗时短，样品用量少，费用低，提取到的芸薹根肿菌DNA纯度高，杂质少，对于研究芸薹根肿菌的遗传多样性研究具有重要的意义。

A method of DNA extraction from Rhizopus brassicae

【技术实现步骤摘要】
一种芸薹根肿菌DNA提取方法
本专利技术属于生物技术、DNA提取
，具体涉及一种芸薹根肿菌DNA提取方法。
技术介绍
根肿病是由芸薹根肿菌侵染引起的一种世界性土传病害，对油菜、大白菜、甘蓝等十字花科作物造成严重的经济损失。芸薹根肿菌属原生动物界根肿菌门根肿菌纲根肿菌属(Plasmodiophora)，专性寄生于十字花科植物。病菌通过侵染活体植物的根毛进入皮层，进而导致根部薄壁细胞膨大而形成肿瘤。寄主植物一旦受到根肿菌侵染，就会影响其对水分和营养成分的吸收，严重时导致植株死亡。现有研究发现根肿菌存在遗传分化，不同来源的根肿菌对寄主的致病性有明显差别。研究芸薹根肿的遗传多样性，有利于确定根肿菌的分化类型，为控制根肿病提供理论依据与基础。现有技术中，在研究芸薹根肿的遗传多样性需要提取芸薹根肿菌的DNA，现有的芸薹根肿菌的DNA提取方法，提取到的DNA混有较多量的寄主大白菜、细菌及真菌的DNA，造成了芸薹根肿菌DNA的纯度较低。
技术实现思路
为了解决上述存在的技术问题，本专利技术提供一种芸薹根肿菌DNA提取方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的。一种芸薹根肿菌DNA提取方法，包括以下操作步骤：(1)将消毒后的根瘤放入抗生素的混合水溶液中浸泡处理20-30小时，将根瘤中的游动孢子变成休眠孢子，用无菌水冲洗处理后的根瘤，其中抗生素的混合水溶液中包括质量浓度为90-110μg/ml链霉素、90-110μg/ml羧苄青霉素、390-410μg/ml特美汀、90-110μg/ml万古霉素、40-60μg/ml潮霉素B和380-420μg/ml纳他霉素；(2)采用40-60％的蔗糖水溶液悬浮法提取根肿菌休眠孢子；(3)将提取的根肿菌休眠孢子加液氮充分研磨后，放入预冷好的离心管中，加入尿素提取液，及时混匀，室温静止8-12min，再向其中加入苯酚混合溶液，震荡处理后，离心处理，移除上清液上方的杂质后，采用云母布过滤，向滤渣中加入异丙醇后，零下35℃到零下45℃下静置处理25-35min后，再次离心处理，将离心沉淀采用乙醇溶液漂洗后，再次离心，将离心沉淀自然晾干后，向其中加入TE缓冲液溶解离心沉淀后，继续向其中加入核糖核酸酶，水浴处理后，得到酶解液；(4)向酶解液中加入与其等体积苯酚混合溶液，离心处理后，再向离心沉淀中加入苯酚混合溶液，再次离心处理后，向其中加入离心液1/10体积的浓度为3mol/L的乙酸钠水溶液和与离心液体积相等的异丙醇，零下35℃到零下45℃下静置处理25-35min，离心处理后除去上清，再向其中加入乙醇溶液，离心处理后弃去上清，再向离心沉淀中加入乙醇溶液漂洗，再次离心处理后，向离心沉淀中加入TE缓冲液溶解离心沉淀后，得到DNA溶液。进一步地，上述步骤(1)中，根肿菌消毒的具体操作为：采用质量分数为10％的次氯酸钠溶液浸泡消毒处理20分钟，然后用无菌水冲洗根肿菌，直到无次氯酸钠的味道。进一步地，上述步骤(2)中，采用40-60％的蔗糖水溶液悬浮法提取根肿菌休眠孢子的具体操作为：取200g经过步骤(1)处理好根肿菌，加500ml无菌水，采用搅拌机研磨2次，每次10秒，研磨后采用8层纱布和1层云母布过滤，将滤液分装在50ml离心管中，4000g的离心力离心10min，弃上清液，在沉淀中加10ml的50％蔗糖溶液，用涡旋振荡器使蔗糖溶液和离心沉淀充分混匀，2000g的离心力下离心10min，用移液器小心移取上清溶液于50ml离心管中，上清溶液中加35ml无菌水，混匀，4000g的离心力离心10min，弃上清，在离心沉淀中加5ml无菌水，4000g的离心力离心10min，然后再在离心沉淀中加5ml无菌水，4000g的离心力离心10min，得到提取好的休眠孢子，然后放于零下80℃保存。进一步地，上述步骤(3)中，每克根肿菌休眠孢子加入4-6ml尿素提取液。进一步地，上述苯酚混合溶液是由苯酚、氯仿、异戊醇按照体积比为25:24:1的比例制成。进一步地，上述每克根肿菌休眠孢子加入20-30μl核糖核酸酶。进一步地，上述步骤(3)中，第一次离心处理时，采用8000g的离心力在4℃的温度下离心10分钟，第二次离心时，采用8000g的离心力离心10分钟，第三次离心处理时，采用8000g的离心力离心5min。进一步地，上述步骤(4)中，第一次离心处理时，采用12000rpm的转速离心10min，第二次离心处理时，采用12000rpm的转速离心10min，第三次离心处理时，采用12000rpm的转速离心5min，第四次离心处理时，采用12000rpm的转速离心10min，第五次离心处理时，采用12000rpm的转速离心10min。由以上的技术方案可知，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的芸薹根肿菌DNA提取方法耗时短，样品用量少，费用低，提取到的芸薹根肿菌DNA纯度高，杂质少，对于研究芸薹根肿菌的遗传多样性具有重要的意义。附图说明图1为实施例1得到的芸薹根肿菌DNA电泳图。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例1将收集好的LNXM-1根肿菌根瘤清洗干净，去皮，用10％的次氯酸钠溶液浸泡20分钟，后用无菌水冲洗根肿菌几次，直到无次氯酸钠的味道。将消毒好的根瘤放在100μg/ml链霉素、100μg/ml羧苄青霉素、400μg/ml特美汀、100μg/ml万古霉素、50μg/ml潮霉素B和400μg/ml纳他霉素的混合溶液中常温处理24小时，使根瘤中的游动孢子变成休眠孢子，处理好之后，用无菌水冲洗根肿菌3次。根肿菌是一种共生菌，不能离体培养，在提取DNA之前应该先提取根肿菌的休眠孢子，减少寄主DNA。本实施例采用50％的蔗糖溶液悬浮法提取根肿菌休眠孢子(试验中使用的器材50ml离心管、纱布、云母布、移液器枪头等均需要高压灭菌)方法如下：取200g经过步骤(1)处理好根瘤，加500ml无菌水，采用搅拌机研磨2次，每次10秒，研磨后采用8层纱布和1层云母布过滤，将滤液分装在50ml离心管中，4000g的离心力离心10min，弃上清液，在沉淀中加10ml的50％蔗糖溶液，用涡旋振荡器使蔗糖溶液和离心沉淀充分混匀，2000g的离心力下离心10min，用移液器小心移取上清溶液于50ml离心管中，上清溶液中加35ml无菌水，混匀，4000g的离心力离心10min，弃上清，在离心沉淀中加5ml无菌水，4000g的离心力离心10min，然后再在离心沉淀中加5ml无菌水，4000g的离心力离心10min，得到提取好的休眠孢子，然后放于零下80℃保存。取1g根肿菌休眠孢子放入研钵中，加液氮充分研磨，在研磨过程中加入研磨珠助研，将研磨好的样本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种芸薹根肿菌DNA提取方法，其特征在于，包括以下操作步骤：/n(1)将消毒后的根瘤放入抗生素的混合水溶液中浸泡处理20-30小时，将根瘤中的游动孢子变成休眠孢子，用无菌水冲洗处理后的根瘤，其中抗生素的混合水溶液中包括质量浓度为90-110μg/ml链霉素、90-110μg/ml羧苄青霉素、390-410μg/ml特美汀、90-110μg/ml万古霉素、40-60μg/ml潮霉素B和380-420μg/ml纳他霉素；/n(2)采用40-60％的蔗糖水溶液悬浮法提取根肿菌休眠孢子；/n(3)将提取的根肿菌休眠孢子加液氮充分研磨后，放入预冷好的离心管中，加入尿素提取液，及时混匀，室温静止8-12min，再向其中加入苯酚混合溶液，震荡处理后，离心处理，移除上清液上方的杂质后，采用云母布过滤，向滤渣中加入异丙醇后，零下35℃到零下45℃下静置处理25-35min后，再次离心处理，将离心沉淀采用乙醇溶液漂洗后，再次离心，将离心沉淀自然晾干后，向其中加入TE缓冲液溶解离心沉淀后，继续向其中加入核糖核酸酶，水浴处理后，得到酶解液；/n(4)向酶解液中加入与其等体积苯酚混合溶液，离心处理后，再向离心沉淀中加入苯酚混合溶液，再次离心处理后，向其中加入离心液1/10体积的浓度为3mol/L的乙酸钠水溶液和与离心液体积相等的异丙醇，零下35℃到零下45℃下静置处理25-35min，离心处理后除去上清，再向其中加入乙醇溶液，离心处理后弃去上清，再向离心沉淀中加入乙醇溶液漂洗，再次离心处理后，向离心沉淀中加入TE缓冲液溶解，得到DNA溶液。/n...

【技术特征摘要】
1.一种芸薹根肿菌DNA提取方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
(1)将消毒后的根瘤放入抗生素的混合水溶液中浸泡处理20-30小时，将根瘤中的游动孢子变成休眠孢子，用无菌水冲洗处理后的根瘤，其中抗生素的混合水溶液中包括质量浓度为90-110μg/ml链霉素、90-110μg/ml羧苄青霉素、390-410μg/ml特美汀、90-110μg/ml万古霉素、40-60μg/ml潮霉素B和380-420μg/ml纳他霉素；
(2)采用40-60％的蔗糖水溶液悬浮法提取根肿菌休眠孢子；
(3)将提取的根肿菌休眠孢子加液氮充分研磨后，放入预冷好的离心管中，加入尿素提取液，及时混匀，室温静止8-12min，再向其中加入苯酚混合溶液，震荡处理后，离心处理，移除上清液上方的杂质后，采用云母布过滤，向滤渣中加入异丙醇后，零下35℃到零下45℃下静置处理25-35min后，再次离心处理，将离心沉淀采用乙醇溶液漂洗后，再次离心，将离心沉淀自然晾干后，向其中加入TE缓冲液溶解离心沉淀后，继续向其中加入核糖核酸酶，水浴处理后，得到酶解液；
(4)向酶解液中加入与其等体积苯酚混合溶液，离心处理后，再向离心沉淀中加入苯酚混合溶液，再次离心处理后，向其中加入离心液1/10体积的浓度为3mol/L的乙酸钠水溶液和与离心液体积相等的异丙醇，零下35℃到零下45℃下静置处理25-35min，离心处理后除去上清，再向其中加入乙醇溶液，离心处理后弃去上清，再向离心沉淀中加入乙醇溶液漂洗，再次离心处理后，向离心沉淀中加入TE缓冲液溶解，得到DNA溶液。


2.根据权利要求1所述的一种芸薹根肿菌DNA提取方法，其特征在于，上述步骤(1)中，根瘤消毒的具体操作为：采用质量分数为10％的次氯酸钠溶液浸泡消毒处理20分钟，然后用无菌水冲洗根瘤，直到无次氯酸钠的味道。


3.根据权利要求1所述的一种芸薹根肿菌DNA提取方法，其特征在于，上述步骤(2)中，采用40-60％的蔗糖水溶液悬浮法提取根肿菌休眠孢子的具体操作为...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓楠，马坡，朴钟云，张丹，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21