核苷酸类似物以及筛选DNA聚合酶的方法技术

本发明专利技术提出了一种核苷酸类似物。该核苷酸类似物具有下列结构，

Nucleotide analogues and methods for screening DNA polymerases

【技术实现步骤摘要】
核苷酸类似物以及筛选DNA聚合酶的方法
本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及核苷酸类似物以及筛选DNA聚合酶的方法。
技术介绍
随着人类基因组的成功解码，基因测序技术应用越来越广泛，其中边合成边测序(SBS)，因其高通量、价格低而倍受青睐。SBS测序技术是利用聚合酶将每个用荧光标记的核苷酸引入到DNA引物中，然后测定来自核苷酸的荧光信号以鉴别该核苷酸的碱基并可同时分析其互补碱基。但是，因用于SBS的三磷酸核苷基本上为双修饰的可逆终止子(DRT)，这些双修饰的可逆终止子是在三磷酸核苷的3’-OH部分具有可逆的阻断基团以及在碱基上具有荧光基团修饰的三磷酸核苷，这种双修饰的方式无法将荧光基团连接到碱基上的连接键在测序后完全除去，因而留下所谓的分子疤，随着测序的进行，新聚合的链包含有更多的分子疤，最终分子疤的积累降低了聚合酶的活性和保真度，导致所测序的碱基数目受到限制。单修饰可逆终止子(MRT)是在3’-OH基团上的，该可逆阻断基团起到双重作用，既作为荧光信号的报道子又作为可逆终止子，该修饰方式可以成功的避免采用DRT修饰时在SBS中所产生的分子疤，从而降低对聚合酶的影响，以提高测序的读长。但是自然条件下选育出来的常规DNA聚合酶并不能利用MRT修饰的三磷酸核苷酸进行有效的聚合反应，为了能使MRT修饰的三磷酸核苷广泛地应用于SBS测序技术中，需要对聚合酶进行适当的人工修饰或改造。另外，也可以减小修饰后的三磷酸核苷酸的大小，以利于酶的聚合反应。但目前对能利用MRT技术的DNA聚合酶，缺失直接、快速、有效的筛选体系和利用体系。
技术实现思路
本申请旨在至少在一定程度上解决现有技术的技术问题之一：本专利技术提出了一种利用荧光共振能量转移(FRET)技术体外高通量筛选DNA聚合酶的方法，该DNA聚合酶能催化作为可逆终止子(MRT)的、3’-OH端带有生物素(Biotin)阻断基团的三磷酸核苷进行聚合反应并可应用于SBS。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种核苷酸类似物。根据本专利技术的实施例，所述核苷酸类似物具有下列结构，其中，L表示可切除连接基团；Label表示第一可检测标记；P表示三磷酸基团；Base表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。其中，L和Lable构成单修饰可逆终止子(MRT)。根据本专利技术的实施例，通过检测核苷酸类似物中的第一可检测标记在聚合反应中的变化，可准确确定待筛选聚合酶是否具有聚合活性。根据本专利技术实施例的所述核苷酸类似物可有效用于筛选具有催化3’-OH端带有可逆终止子(MRT)的三磷酸核苷酸发生聚合反应的活性并可用于SBS的聚合酶。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种筛选DNA聚合酶的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：使含有核酸分子、核苷酸类似物和候选DNA聚合酶的反应混合物置于适于发生DNA聚合反应的第一条件下；对所述反应混合物中的第一可检测标记进行检测；以及基于所述检测结果，确定目标DNA聚合酶，其中，所述核酸分子具有双链区和5’-单链区，所述5’-单链区具有双链区毗邻核苷酸；所述核苷酸类似物为前面所述的核苷酸类似物，并且所述核苷酸类似物的碱基与所述双链区毗邻核苷酸的碱基匹配。利用根据本专利技术实施例的方法，以核酸分子为模板，候选DNA聚合酶或可催化本专利技术的核苷酸类似物在核酸分子的3’端发生聚合反应，通过检测反应混合物中的第一可检测标记，基于第一可检测标记在反应过程中的变化或反应前和反应的后的差异，确定具有催化本专利技术所述的核苷酸类似物发生聚合反应的DNA聚合酶，而本专利技术所述的核酸类似物的3’-OH端连接有MRT，因此，利用根据本专利技术实施例的方法，可高效筛选出具有催化3’-OH端带有可逆终止子(MRT)的三磷酸核苷酸发生聚合反应的活性并可用于SBS的DNA聚合酶。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1是根据本专利技术实施例的核酸分子的结构示意图；图2是根据本专利技术实施例的核酸分子的结构示意图；图3是根据本专利技术实施例的核酸分子的结构示意图；图4是根据本专利技术实施例的采用FRET技术检测筛选体的活性的原理示意图；以及图5是根据本专利技术实施例的酶标仪检测酶活曲线图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。术语解释需要说明的是，如无特别说明，本申请所述的“适于发生DNA聚合反应的条件”是指能够使三磷酸核苷酸在DNA聚合酶的催化下，发生聚合反应的常规条件，包括反应体系条件、温度条件、pH条件等，例如，反应体系中的反应缓冲液包括20mMTris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mMKCl、30mMMgSO4，反应缓冲液的pH为8.8，反应温度为40～60℃。本申请所述的核酸分子中的“5’-单链区”是指位于核酸分子的5’端的单链区，例如图1、图2或图3中所示的核酸分子的结构，其5’-单链区如图所示。如无特别说明，在本文中所使用的“第一”、“第二”、“第三”等类似术语均为用于描述方便而进行区分的目的，并不以任何目的暗示或者明示互相之间存在顺序或者重要性等差异，同时并不意味着由“第一”、“第二”、“第三”等类似术语所限定的内容仅有一种成分构成。核苷酸类似物在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种核苷酸类似物。根据本专利技术的实施例，所述核苷酸类似物具有下列结构，其中，L表示可切除连接基团；Label表示第一可检测标记；P表示三磷酸基团；Base表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。其中，L和Label构成单修饰可逆终止子(MRT)。根据本专利技术的实施例，通过检测核苷酸类似物中的第一可检测标记在聚合反应中的变化，可准确确定待筛选聚合酶是否具有聚合活性。根据本专利技术实施例的所述核苷酸类似物可有效用于筛选具有催化3’-OH端带有可逆终止子(MRT)的三磷酸核苷酸发生聚合反应的活性并可用于SBS的聚合酶。根据本专利技术的实施例，所述连接基团L具有下列结构，根据本专利技术实施例的核苷酸类似物在完成碱基检测后，上述连接基团可被切割，如在有机膦化物的作用下进行切割处理，实现边合成边测序(SBS)。根据本专利技术的实施例，所述第一可检测标记为生物素标记或荧光标记。利用生物素标记三磷酸核苷酸，后续再利用亲和素捕捉生物素标记的三磷酸核苷酸，而亲和素可选择荧光标记的亲和素，进而可利用荧光反应测定碱基；第一可检测标记为荧光标记，则可直接利用荧光标记的荧光反应来测定碱基。根据本专利技术的实施例，所述核苷酸类似物具有下列结构：根据本专利技术实施例的上述核苷酸类似物利用生物素标记三磷酸核苷酸，后续再利用亲和素捕捉该生物素标记的三本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核苷酸类似物，其特征在于，具有下列结构，/n

【技术特征摘要】
1.一种核苷酸类似物，其特征在于，具有下列结构，



其中，
L表示可切除连接基团；
Label表示第一可检测标记；
P表示三磷酸基团；
Base表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶；
优选地，所述可切除连接基团L具有下列结构，



任选地，所述第一可检测标记为生物素标记或荧光标记。


2.一种筛选DNA聚合酶的方法，其特征在于，包括：
使含有核酸分子、核苷酸类似物和候选DNA聚合酶的反应混合物置于适于发生DNA聚合反应的第一条件下；
对所述反应混合物中的第一可检测标记进行检测；以及
基于所述检测结果，确定目标DNA聚合酶，
其中，
所述核酸分子具有双链区和5’-单链区，所述5’-单链区具有双链区毗邻核苷酸；
所述核苷酸类似物为权利要求1所述的核苷酸类似物，并且所述核苷酸类似物的碱基与所述双链区毗邻核苷酸的碱基匹配。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述核酸分子为线型，所述核酸分子的两端分别具有一个5’-单链区；
任选地，两个5’-单链区具有相同的所述双链区毗邻核苷酸；
任选地，所述5’-单链区携带第二可检测标记。


4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述核酸分子为线型，所述核酸分子有且仅有一端具有一个5’-单链区；
任选地，所述5’-单链区和/或非5’-单链区所在核酸链的5端’携带第二可检测标记。


5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述核酸分子为环型，所述核酸分子具有一个5’-单链区；
任选地，非5’-单链区所在核酸链的5端’携带第二可检测标记。


6.根据权利要求3～5任一项所述的方法，其特征在于，所述第一可检测标记的检测体系和所述第二可检测标记被设置为适于发生共振能连转移；
任选地，所述第二可检测标记和第一可检测标记的检测体系的间隔为不大于30nt；
优选地，所述第二可检测标记和第一可检测标记的检测体系的间隔为15～30nt。


7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一可检测标记为生物素，所述第一可检测标记的检测体系包括携带第一荧光标记的链霉亲和素，所述第二可检测标记为第二荧光标记，所述第一荧光标记与所述第二荧光标记之间适于发生共振能连转移；
任选地，所述第...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘芬，王林，董宇亮，章文蔚，郑越，徐崇钧，翟莉莉，王鹤，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44