百日咳杆菌气管细胞毒素的筛查方法和含量测定方法技术

本发明专利技术提供了一种百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的筛查方法及含量测定方法，含量检测方法包括以下步骤：(1)标准工作曲线的绘制：称取适量百日咳杆菌气管细胞毒素对照品，配制成标准工作溶液；将标准工作溶液用高效液相色谱串联质谱进行分析，即可得到对照品的色谱图，根据溶液浓度与对应色谱峰面积的关系得到标准工作曲线；样品检测：取待测样品加入同等体积乙腈，混匀后，离心，取上清液用高效液相色谱串联质谱进行分析检测，根据待测组分的响应峰面积和标准工作曲线，得出待测组分百日咳杆菌气管细胞毒素的含量。本方法具有超高灵敏度，且比欧洲药典要求的限度低1409倍。

Screening method and content determination of tracheal cytotoxin of pertussis

【技术实现步骤摘要】
百日咳杆菌气管细胞毒素的筛查方法和含量测定方法
本专利技术具体涉及一种百日咳毒素产品和百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量测定方法。属于疫苗质量评价

技术介绍
百日咳杆菌气管细胞毒素是百日咳杆菌培养上清液中的一种分子量为921的糖肽。百日咳杆菌气管细胞毒素能依附于地鼠气管上皮细胞，造成气管组织培养破坏，延长受损纤毛细胞的恢复和阻断下层新生基底细胞群的分裂和分化。百日咳杆菌气管细胞毒素可导致百日咳患者难以通过使用药物缓解临床症状。当百日咳杆菌气管细胞毒素存在时，即使百日咳杆菌不再存在，百日咳患者的咳嗽症状仍能持续数周以上。Rosenthal和Goldman等人研究结果指出95％以上百日咳杆菌气管细胞毒素是分子量为921的糖肽。如果百日咳或百白破疫苗中存在百日咳杆菌气管细胞毒素将导致疫苗接种者出现百日咳病症，严重危害人类健康。因此，必须严格控制百日咳和百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量，以减少相关疫苗的危害事件发生。《欧洲药典》对百日咳杆菌气管细胞毒素的残留量有严格要求(每剂量疫苗中含量不高于2pmol)，但缺乏百日咳杆菌气管细胞毒素含量测定的具体方法。不仅《欧洲药典》未收录百日咳杆菌气管细胞毒素含量测定方法，《中国药典》及世界上其他国家和组织的药典均未收录百日咳杆菌气管细胞毒素含量测定的方法。可能的原因为：第一，缺乏百日咳杆菌气管毒素对照品；第二，百日咳杆菌气管细胞毒素紫外吸收较差，难以用HPLC-UV方法直接检测。柱前衍生的方法可提高百日咳杆菌气管细胞毒素的紫外响应，且在较宽范围内具有较好线性(14pmol～7000pmol)，但灵敏度仍不能满足欧洲药典对疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的限量要求。此外，衍生反应效率受样品基质和衍生条件的影响较大，其重复性和准确度难以保障。液相色谱质谱法具有较高的检测灵敏度和选择性，可用于复杂样品中目标化合物的高灵敏度检测。虽然质谱技术发展至今已非常成熟，但由于没有商品化的百日咳杆菌气管细胞毒素对照品且百日咳杆菌气管细胞毒素的对照品制备非常困难，至今尚无HPLC-MS/MS(高效液相色谱-质谱联用)检测百日咳杆菌气管细胞毒素的方法报道。
技术实现思路
本专利技术为了解决因为百日咳杆菌气管细胞毒素对照品缺乏造成的百日咳杆菌气管细胞毒素检测方法难以实施的现状，提供一种HPLC-MS/MS方法检测百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的方法，本方法只需在本次方法建立时使用百日咳杆菌气管细胞毒素对照品，而方法实施过程中无须百日咳杆菌气管细胞毒素对照品即可筛查样品中是否存在百日咳杆菌气管细胞毒素。本专利技术所用对照品为本技术专利技术单位之一中国食品药品检定科学研究院制备，通过高分辨质谱全扫描模式确定其纯度，采用高分辨质谱一级、二级质谱信息后结合糖肽裂解规律确定百日咳杆菌气管细胞毒素结构。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：一种百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的筛查方法，步骤如下：取待测样品加入同等体积乙腈，混匀后，离心，取上清液用高效液相色谱串联质谱进行分析检测，根据样品中是否有百日咳杆菌气管细胞毒素特征离子对检出和检出离子对的离子比确定样品中是否含有百日咳杆菌气管细胞毒素。其中，样品中是否含有百日咳杆菌气管细胞毒素的定性依据为：a)样品同时检出以下三组离子对922.3/719.3,922.3/391.1,922.3/302.1；b)922.3/719.3与922.3/391.1的离子比在10％-60％范围内，922.3/719.3与922.3/302.1的离子比在40％-90％范围内；条件a)和b)均满足时，样品中含有百日咳杆菌气管细胞毒素。优选的，所述离心速度为14000r/min；离心时间10min。一种百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量测定方法，包括以下步骤：(1)标准工作曲线的绘制：称取适量百日咳杆菌气管细胞毒素对照品，用体积比为50:50的乙腈/水溶液配制成标准工作溶液；将标准工作溶液用高效液相色谱串联质谱进行分析，即可得到对照品的色谱图，根据溶液浓度与对应色谱峰面积的关系得到标准工作曲线；(2)样品检测：取待测样品加入同等体积乙腈，混匀后，离心，取上清液用高效液相色谱串联质谱进行分析检测，根据待测组分的响应峰面积和标准工作曲线，得出待测组分百日咳杆菌气管细胞毒素的含量。优选的，所述离心速度为14000r/min；离心时间10min。优选的，配制标准工作溶液的具体方法为：称取适量百日咳杆菌气管细胞毒素对照品，用体积比为50:50的乙腈/水溶液配制成浓度为1μg/L的标准母液备用；用体积比为50:50的乙腈/水溶液稀释上述母液到0.00029-1μg/L浓度范围，得到标准工作溶液，标准工作溶液浓度点分别为0.369、0.185、0.092、0.046、0.023、0.012、0.0058μg/L。优选的，上述百日咳杆菌气管细胞毒素标对照品是从百日咳Cs菌株中分离、纯化而得，所述百日咳杆菌气管细胞毒素对照品的制备过程如下：1)浓缩培养液：百日咳杆菌培养液在4℃下采用高速离心的方法去除大分子杂质，高速离心，取上清液过0.22μm醋酸纤维素膜，去除溶液中的大分子杂质，收集滤液，用三氟乙酸滤过液至pH为3；2)用生物兼容C18柱纯化百日咳杆菌气管细胞毒素：用甲醇和三氟乙酸水溶液依次洗涤生物兼容C18填料；将步骤1)酸化后的滤液注入生物兼容柱中，然后加入洗涤后的生物兼容C18填料；将生物兼容柱中的溶液抽干，再用三氟乙酸水洗涤生物兼容柱，百日咳杆菌气管细胞毒素产品被生物兼容C18填料富集；再用含三氟乙酸、正丁醇和水的溶液洗脱被富集的百日咳杆菌气管细胞毒素产品，并收集馏分；减压浓缩馏分以备QMA柱纯化；3)QMA纯化：用溶液Ⅰ浸润QMA柱10min，在用20mL溶液Ⅰ洗C18柱；接着用20mL溶液Ⅱ洗C18柱；再用20mL甲醇清洗C18柱；最后用20mL溶液Ⅰ平衡C18柱；平衡好后，将减压浓缩所得馏分注入QMA柱，再用溶液Ⅰ洗涤未结合蛋白；然后用溶液Ⅱ洗脱收集百日咳杆菌气管细胞毒素产品；4)脱盐得百日咳杆菌气管细胞毒素对照品：用三氟乙酸酸化百日咳杆菌气管细胞毒素产品，再按步骤2)上样并收集百日咳杆菌气管细胞毒素脱盐馏分，冻干百日咳杆菌气管细胞毒素脱盐馏分，得百日咳杆菌气管细胞毒素对照品。优选的，步骤1)所述高速离心的转数为13,200xg，离心时长为20分钟；步骤2)所述三氟乙酸水溶液为三氟乙酸：水的体积比(v/v)为1:1000；步骤2)所述三氟乙酸、正丁醇、水的体积比为1:200:800。进一步优选的，所述溶液Ⅰ为含有10mmol/L乙酸铵的体积浓度为20％甲醇水溶液(pH5.5)。进一步优选的，所述溶液Ⅱ为含有10mmol/L乙酸铵和1mol/L氯化钠的体积浓度为20％甲醇水溶液(pH5.5)。进一步优选的，百日咳杆菌气管细胞毒素对照品纯度测定方法，包括以下步骤：称取适量百日咳杆菌气管细胞毒素对照品，用乙腈：水(5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)标准工作曲线的绘制：称取适量百日咳杆菌气管细胞毒素对照品，配制成标准工作溶液；将标准工作溶液用高效液相色谱串联质谱进行分析，即可得到对照品的色谱图，根据溶液浓度与对应色谱峰面积的关系得到标准工作曲线；/n(2)样品检测：取待测样品加入同等体积乙腈，混匀后，离心，取上清液用高效液相色谱串联质谱进行分析检测，根据待测组分的响应峰面积和标准工作曲线，得出待测组分百日咳杆菌气管细胞毒素的含量。/n

【技术特征摘要】
1.一种百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)标准工作曲线的绘制：称取适量百日咳杆菌气管细胞毒素对照品，配制成标准工作溶液；将标准工作溶液用高效液相色谱串联质谱进行分析，即可得到对照品的色谱图，根据溶液浓度与对应色谱峰面积的关系得到标准工作曲线；
(2)样品检测：取待测样品加入同等体积乙腈，混匀后，离心，取上清液用高效液相色谱串联质谱进行分析检测，根据待测组分的响应峰面积和标准工作曲线，得出待测组分百日咳杆菌气管细胞毒素的含量。


2.根据权利要求1所述的一种百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量测定方法，其特征在于，所述百日咳杆菌气管细胞毒素标对照品是从百日咳Cs菌株中分离、纯化而得，所述百日咳杆菌气管细胞毒素标对照品的制备过程如下：
1)浓缩培养液：百日咳杆菌培养液在4℃下采用高速离心的方法去除大分子杂质，高速离心，取上清液过0.22μm醋酸纤维素膜，去除溶液中的大分子杂质，收集滤液，用三氟乙酸酸滤过液至pH为3；
2)用生物兼容C18柱纯化百日咳杆菌气管细胞毒素：用甲醇和三氟乙酸水溶液依次洗涤C18填料；将步骤1)酸化后的滤液注入生物兼容柱中，然后加入洗涤后的C18填料；将生物兼容柱中的溶液抽干，再用三氟乙酸水洗涤生物兼容柱，百日咳杆菌气管细胞毒素产品被生物兼容C18填料富集；再用含三氟乙酸、正丁醇和水的溶液洗脱被富集的百日咳杆菌气管细胞毒素产品，并收集馏分；减压浓缩馏分以备QMA柱纯化；
3)QMA纯化：用溶液Ⅰ浸润QMA柱10min，在用20mL溶液Ⅰ洗生物兼容C18柱；接着用20mL溶液Ⅱ洗生物兼容C18柱；再用20mL甲醇清洗C18柱；最后用20mL溶液Ⅰ平衡生物兼容C18柱；平衡好后，将减压浓缩所得馏分注入QMA柱，再用溶液Ⅰ洗涤未结合蛋白；然后用溶液Ⅱ洗脱收集百日咳杆菌气管细胞毒素产品；
4)脱盐得百日咳杆菌气管细胞毒素对照品：用三氟乙酸酸化百日咳杆菌气管细胞毒素产品，再按步骤2)上样并收集百日咳杆菌气管细胞毒素脱盐馏分，冻干百日咳杆菌气管细胞毒素脱盐馏分，得百日咳杆菌气管细胞毒素对照品。


3.根据权利要求2所述的一种百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量测定方法，其特征在于，步骤1)所述高速离心的转数为13,200xg，离心时长为20分钟；步骤2)所述三氟乙酸水溶液为三氟乙酸：水的体积比为1:1000；步骤2)所述三氟乙酸、正丁醇、水的体积比为1:200:800。


4.根据权利要求2所述的一种百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量测定方法，其特征在于，所述溶液Ⅰ为含有10mmol/L乙酸铵的体积浓度为20％甲醇水溶液；所述溶液Ⅱ为含有10mmol/L乙酸铵和1mol/L氯化钠的体积浓度为20％甲醇水溶液。


5.根据权利要求1所述的一种百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量测定方法，其特征在于，所述百日咳杆菌气管细胞毒素对照品纯度测定的具体方法为：称取适量百日咳杆菌气管细胞毒素对照品，用乙腈：水溶解并稀释到1μg/L，用LC-IT-TOF扫描一级谱图，确认百日咳杆菌气管细胞毒素对照品的纯度；
所述百日咳杆菌气管细胞毒素纯度计算方法：样品中所有峰的峰面积相加得总峰面积，百日咳杆菌气管细胞毒素的纯度＝百日咳杆菌气管细胞毒素峰面积/总峰面积x100％。


6.根据权利要求1所述的一种百日咳或百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素的含量测定方法，其特征在于，百日咳杆菌气管细胞毒素结构鉴定...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙珍，卫辰，李月琪，马霄，姚劲挺，冀峰，李长坤，谭亚军，黄涛宏，
申请(专利权)人：岛津企业管理中国有限公司，中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11