一种同时制备两种单克隆抗体的方法技术

本发明专利技术公开了一种同时制备两种单克隆抗体的方法，所述方法以33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白的偶联物作为抗原免疫小鼠，选取免疫后抗体水平较高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，再通过33F肺炎多糖、乙肝表面蛋白以及33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白偶联物作为抗原进行特异性筛选，获得杂交瘤细胞，同时制备出特异性识别33F肺炎多糖和乙肝表面蛋白的单克隆抗体。本发明专利技术这种以乙肝表面蛋白为载体的肺炎偶联物免疫后同时制备分别针对多糖与蛋白的单克隆细胞株细胞及特异性单抗的方法，节省了工作量，提高筛选效率，同时本发明专利技术提供的两种单抗具有特异性高，敏感度高及传代稳定性好的优势。

A method of preparing two monoclonal antibodies at the same time

【技术实现步骤摘要】
一种同时制备两种单克隆抗体的方法
本专利技术涉及单克隆抗体
，尤其涉及一种同时制备两种单克隆抗体的方法。
技术介绍
肺炎球菌和乙肝病毒是危害人类健康的两大病原微生物。针对肺炎球菌和乙肝病毒的疫苗的成功上市为预防和控制该类疾病提供了有效手段。而在这两种疫苗研发和生产的过程中需要通过对有效抗原成分的测定来进行质量控制。在抗原含量的检测上，目前，肺炎疫苗的抗原含量主要采用化学基团法进行测定，通过化学基团的理论比例来判断其含量。不能完全体现其生物活性。与传统的理化方法相比，利用抗原和抗体在体外特异性结合的方法，对样品中的抗原进行定性或定量检测更具有特异性。而现有的肺炎血清国际标准品是一种来自于人类的多抗血清，且数量有限，对不同的型别的适用情况需要进行实验摸索及验证。因此，单克隆抗体由于针对抗原表位的唯一性已成为继多克隆抗体后更为敏感和有效的手段而应用于抗原的检测中。虽然，已有用偶联疫苗进行流脑多糖单克隆细胞株和抗体制备的研究报道，但并未见同时将偶联蛋白单克隆细胞制备工作和多糖抗原单克隆细胞制备一起考虑的报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种通知制备两种单克隆抗体的方法，本专利技术通过一个实验能同时筛选出针对多糖和载体蛋白的单克隆抗体，节省了工作量，提高了筛选效率。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案如下：一种同时制备两种单克隆抗体的方法，所述方法以33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白的偶联物作为抗原免疫小鼠，选取免疫后抗体水平较高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，再通过33F肺炎多糖、乙肝表面蛋白以及33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白的偶联物作为抗原进行特异性筛选，获得杂交瘤细胞，同时制备出特异性识别33F肺炎多糖和乙肝表面蛋白的单克隆抗体。进一步地，所述方法具体步骤如下：步骤(1)将33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白的偶联物抗原与弗氏佐剂混匀后进行免疫小鼠，最后一次免疫后7天于眼眦采血，分离血清，检测OD450吸光值，筛选OD450吸光值最高的小鼠分离脾淋巴细胞用于后续融合；步骤(2)将小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合，加入PEG4000进行细胞融合，融合后将细胞按有限稀释法稀释后接种于96孔培养板中，用含10％胎牛血清的HAT选择培养基进行选择培养得到融合细胞；步骤(3)融合细胞经有限稀释并培养至单层时，吸取细胞上清，对细胞上清初筛选用33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白偶联物进行细胞上清抗体效价检测，复筛再分别进行抗33F型肺炎多糖和抗乙肝表面蛋白的抗体效价检测，挑选阳性孔进行有限稀释后直至阳性率达到100％，分别选取抗33F肺炎多糖阳性孔和抗乙肝表面蛋白阳性孔中OD450值最高的细胞进行扩大培养；步骤(4)将筛选出的细胞株扩大培养后，制备小鼠腹水，并分别针对筛选出的细胞株做特异性鉴定，得到分别特异性识别33F型肺炎多糖和33F型肺炎多糖的单克隆抗体及相应的杂交瘤细胞株。进一步地，所述33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白偶联物免疫小鼠时免疫过程如下：以0天-14天-28天三针的方式进行免疫，免疫剂量为1μg/次·只，免疫部位为腹股沟皮下免疫。进一步地，步骤(3)所述血清抗体检测过程如下：对细胞上清初筛选用33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白偶联物进行细胞上清抗体效价检测，复筛再分别进行抗33F型肺炎多糖和抗乙肝表面蛋白的抗体效价检测，初筛和复筛时将抗原稀释至50ng/ml包被酶标板，4℃过夜，洗涤后，用含脱脂奶粉的封闭液37℃封闭2h后，将小鼠血清10倍稀释后，按每孔50μl加入后37℃孵育2h后洗板；每孔按1∶5000加入酶标二抗50μl，37℃孵育1h后洗板；加入底物显色液进行显色并测定OD450吸光值。本专利技术还提供上述方法得到的杂交瘤细胞株，其中一株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体能够特异性识别33F肺炎多糖、33F肺炎多糖乙肝表面蛋白结合物及含有33F肺炎多糖的结合疫苗；所述杂交瘤细胞株分类命名为杂交瘤细胞株WV-PN33F-01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC：C2019169，保藏时间为2019年9月5日，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。另外一株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体能够特异性识别乙肝表面蛋白、33F肺炎多糖乙肝表面蛋白结合物及含有乙肝表面蛋白的结合疫苗；所述杂交瘤细胞株分类命名为杂交瘤细胞株WV-HBV-01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC：C2019168，保藏时间为2019年9月5日，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。本专利技术特点之一在于：目前获得33F肺炎多糖和乙肝表面蛋白的单克隆抗体是采用融合的细胞进行单克隆制备，通常以单一抗原制备单一单克隆细胞。如需要进行2种以上的单克隆细胞，则需要用不同的抗原分别对小鼠进行免疫、细胞融合和筛选，存在工作量大，流程复杂、时间较长的弊端。而且33F肺炎链球菌的荚膜多糖属于TI抗原，其诱导的体液免疫抗体效价低且不产生免疫记忆。本专利技术通过采用33F型肺炎球菌多糖与乙肝表面蛋白共价偶联的方式制备的偶联物，克服了纯化多糖在小鼠中免疫应答的不足，加强免疫后能产生较高水平的血清抗体水平。而且本专利技术能够同时获得分别特异性识别33F肺炎多糖和乙肝表面蛋白的单克隆抗体以及分泌抗体的杂交瘤细胞株，通过一个实验就能得到两种分泌单克隆抗体的细胞株，提高了单抗细胞株的筛选效率，为细菌多糖疫苗特别是多价蛋白偶联疫苗的单克隆细胞株的快速制备提供了一种更高效和更具有针对性的可能。本专利技术特点之二在于：本专利技术制备得到的单克隆抗体特异性高，通用型好。以33F肺炎荚膜多糖为例，在制备肺炎多糖-蛋白结合疫苗及多价结合疫苗过程中，多糖或蛋白的抗原表面位点容易被覆盖，且多糖与不同载体蛋白结合时，被覆盖的抗原表面会点可能不同；现有方法得到的单抗，可能无法特异性识别多种多糖蛋白结合物。本专利技术得到的杂交瘤细胞株分泌的抗33F肺炎荚膜多糖单克隆抗体进行特异性鉴定，其不仅能识别33F肺炎荚膜多糖，还能识别33F肺炎荚膜多糖与破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉无毒变异体蛋白以及乙肝表面蛋白的结合物，特异性高，通用性好。本专利技术特点之三在于：本研究通过采用33F型肺炎球菌多糖与乙肝表面蛋白共价偶联的方式制备的偶联物，克服了纯化多糖在小鼠中免疫应答的不足，同时，加强免疫后能产生较高水平的血清抗体水平。实验初步表明，以1μg/0.2ml的多糖含量、腹股沟皮下注射、间隔14天免疫3次的方式能诱导相对较高水平的抗体。相对于肌肉注射，皮下组织中有丰富的抗原提呈细胞，能更有效的刺激机体免疫系统，产生更多有特异性表型的B淋巴细胞，这为获得肺炎33F型和乙肝表面蛋白，特别是肺炎33F型的单克隆细胞株和抗体奠定了基础。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术这种以乙肝表面蛋白为载体的肺炎偶联物免疫后同时制备分别针对多糖与蛋白的单克隆细胞株细胞及特异性单抗的方法，节省了工作量，提高筛选效率，为细菌多糖疫苗特别是多价蛋白偶联疫苗的单克隆细胞株的快速制备提供了一种更高效和更具有针对性的可能。同时本专利技术提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时制备两种单克隆抗体的方法，其特征在于，所述方法以33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白的偶联物作为抗原免疫小鼠，选取免疫后抗体水平较高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，再通过33F肺炎多糖、乙肝表面蛋白以及33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白的偶联物作为抗原进行特异性筛选，获得杂交瘤细胞，同时制备出特异性识别33F肺炎多糖和乙肝表面蛋白的单克隆抗体。/n

【技术特征摘要】
1.一种同时制备两种单克隆抗体的方法，其特征在于，所述方法以33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白的偶联物作为抗原免疫小鼠，选取免疫后抗体水平较高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，再通过33F肺炎多糖、乙肝表面蛋白以及33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白的偶联物作为抗原进行特异性筛选，获得杂交瘤细胞，同时制备出特异性识别33F肺炎多糖和乙肝表面蛋白的单克隆抗体。


2.如权利要求1所述的同时制备两种单克隆抗体的方法，其特征在于，所述方法具体步骤如下：
步骤(1)将33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白的偶联物抗原与弗氏佐剂混匀后进行免疫小鼠，最后一次免疫后7天于眼眦采血，分离血清，检测OD450吸光值，筛选OD450吸光值最高的小鼠分离脾淋巴细胞用于后续融合；
步骤(2)将小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合，加入PEG4000进行细胞融合，融合后将细胞按有限稀释法稀释后接种于96孔培养板中，用含10％胎牛血清的HAT选择培养基进行选择培养得到融合细胞；
步骤(3)融合细胞经有限稀释并培养至单层时，吸取细胞上清，对细胞上清初筛选用33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白偶联物进行细胞上清抗体效价检测，复筛再分别进行抗33F型肺炎多糖和抗乙肝表面蛋白的抗体效价检测，挑选阳性孔进行有限稀释后直至阳性率达到100％，分别选取抗33F肺炎多糖阳性孔和抗乙肝表面蛋白阳性孔中OD450值最高的细胞进行扩大培养；
步骤(4)将筛选出的细胞株扩大培养后，制备小鼠腹水，并分别针对筛选出的细胞株做特异性鉴定，得到分别特异性识别33F型肺炎多糖和33F型肺炎多糖的单克隆抗体及相应的杂交瘤细胞株。


3.如权利要求2所述的同时制备两种单克隆抗体的方法，其特征在于，所述33...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱雯，陈南萍，王丽丽，陈玉秋，吴凯，陈敏，赵志宏，奚树花，范荣坤，
申请(专利权)人：云南沃森生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53