【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于冷冻电子显微镜的气相样品制备关于联邦政府赞助的研究或开发的声明本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的GM118110的政府支持下完成的。政府拥有本专利技术的某些权利。相关申请的交叉引用本申请要求2017年7月7日提交的美国临时专利申请编号62/529,778的优先权，在不与本公开内容相抵触的程度上通过引证将其纳入本文。专利技术背景X射线晶体学传统上是为生物学研究提供结构分析的标准，虽然X射线晶体学仍提供高分辨率的结构信息，但是该技术具有一些缺点。其局限之一为X射线晶体学需要大量的样品。这使得X射线晶体学在难以产生大量、高纯度目标分子的情况下并不实用。单颗粒冷冻电子显微镜(cryo-EM)正在成为对真核细胞、蛋白质(＞150kDa)和大分子复合物(例如脂质体、细胞器和病毒)结构研究的有力替代方法(Stark等人，Microscopy，2016，65(1)：23-34))。冷冻电子显微镜是独特的，提供非晶体样品的3D结构信息，同时也常常需要比X射线晶体学更少的样品量。随着新型电子检测器的发展和软件图像重建的进步，冷冻电子显微镜已接近原子级分辨率，使得许多新的生物学发现成为可能。这项技术引起了人们相当大的兴趣，但它仍然存在许多局限性，包括仍然比理论上可行的低四倍的分辨率(Glaeser，R.M.，NatureMethods，2016，13(1)：28-32)。大多数局限是由于样品制备导致，样品制备通常需要纯化和玻璃化。将样品包裹于玻璃态冰(即无定形冰)中有助于保护样品免受电子显微镜带来的辐射损伤。...
【技术保护点】
1.一种制备用于冷冻电子显微镜(cryo-EM)的样品的方法，包括以下步骤：/na)形成原子或分子的蒸汽流；/nb)引导蒸汽流朝向基体表面，使原子或分子在真空下撞击基体表面，其中基体表面处于-100℃或更低的温度，从而在基体表面上形成原子或分子的无定形固体层，其中无定形固体层具有2微米或更小的厚度；/nc)形成含有带电或不带电分析物颗粒的分析物束；和/nd)使无定形固体层与分析物束接触，从而将分析物颗粒嵌在沉积的无定形固体层之上或之内。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170707 US 62/529,7781.一种制备用于冷冻电子显微镜(cryo-EM)的样品的方法，包括以下步骤：
a)形成原子或分子的蒸汽流；
b)引导蒸汽流朝向基体表面，使原子或分子在真空下撞击基体表面，其中基体表面处于-100℃或更低的温度，从而在基体表面上形成原子或分子的无定形固体层，其中无定形固体层具有2微米或更小的厚度；
c)形成含有带电或不带电分析物颗粒的分析物束；和
d)使无定形固体层与分析物束接触，从而将分析物颗粒嵌在沉积的无定形固体层之上或之内。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括在所述分析物颗粒已被嵌在无定形固体层上之后使无定形固体层与来自蒸汽流的原子或分子额外接触。
3.根据权利要求1所述的方法，还包括在使基体表面与来自蒸汽流的原子或分子接触的同时使基体表面与分析物束接触。
4.根据权利要求1-3所述的方法，其中蒸汽流包含能够形成无定形固体的分子或原子，所述分子或原子包含环己醇、甲醇、乙醇、异戊烷、水、O2、Si、SiO2、S、C、Ge、Fe、Co和Bi中的一种或多种。
5.根据权利要求1-4所述的方法，其中蒸汽流包含水分子。
6.根据权利要求1-5所述的方法，其中蒸汽流包含带电分子。
7.根据权利要求1-6所述的方法，其中基体为电子显微镜(EM)网格，其包含跨越EM网格的顶部或底部表面的连续的薄膜或隔膜。
8.根据权利要求1-7所述的方法，其中蒸汽流的原子或分子在等于或小于10-4Torr的压力下接触基体表面。
9.根据权利要求1-7所述的方法，其中所述使无定形固体层与分析物束接触的步骤在10-4Torr的压力下进行。
10.根据权利要求1-9所述的方法，还包括使用冷冻电子显微镜分析无定形固体层之上或之内的所述分析物颗粒的步骤。
11.根据权利要求1-10所述的方法，其中分析物束为离子束。
12.根据权利要求11所述的方法，其中离子束是使用电喷雾电离或激光解吸而产生的。
13.根据权利要求11所述的方法，其中分析物颗粒在非变性电喷雾条件下被离子化，以便不扰乱颗粒的结构构象。
14.根据权利要求1-10所述的方法，其中分析物束为分子束。
15.根据权利要求14所述的方法，其中分析物分子束通过生成含有分析物颗粒的溶液的气溶胶并将所述气溶胶引入真空系统中而产生。
16.根据权利要求1-10所述的方法，其中分析物束为颗粒束。
17.根据权利要求1-16所述的方法，其中分析物束的特征在于强度选自每秒每1μm20.025至25个颗粒的范围。
18.根据权利要求1-17所述的方法，其中分析物束的特征在于至少90％的纯度。
19.根据权利要求1-18所述的方法，其中分析物束的特征在于至少90％的构象纯度。
20.根据权利要求1-19所述的方法，其中分析物束的特征在于斑点尺寸选自800μm2至3.8E7μm2的范围。
21.根据权利要求1-20所述的方法，其中沉积的分析物颗粒在无定形固体层内至少基本上随机取向。
22.根据权利要求1-21所述的方法，其中分析物颗粒为通过非共价相互作用而复合在一起的分子实体、单个分子或多个分子。
23.根据权利要求1-22所述的方法，其中分析物颗粒为蛋白质分子、多蛋白质复合物、蛋白质/核酸复合物、核酸分子、病毒颗粒、微生物、亚细胞组分或全细胞。
24.根据权利要求1-23所述的方法，其中蒸汽流是使用克努森型渗出池、分子束剂量计或基质与分析物向系统的共渗入而生成的。
25.根据权利要求1-24所述的方法，其中蒸汽流的特征在于强度选自每秒每μm24.8E9至2.8E11个分子的范围。
26.根据权利要求1-25所述的方法，其中蒸汽流的特征在于至少90％的纯度。
27.根据权利要求1-26所述的方法，其中蒸汽流的特征在于斑点尺寸选自800μm2至3.8E7μm2的范围。
28.根据权利要求1-27所述的方法，其中所述蒸汽流包含在7mm2面积上具有98％以内均匀度的分子通量。
29.根据权利要求1-28所述的方法，其中所述蒸汽流颗粒的入射轨迹为垂直于所述基体表面的1度以内。
30.根据权利要求1-29所述的方法，还包含在接触基体表面之前，使蒸汽流的原子或颗粒从一个或多个反射表面反射。
31.根据权利要求1-30所述的方法，其中基体表面处于-175℃或更低的温度。
32.根据权利要求1-31所述的方法，其中无定形固体层具有小于或等于1％的结晶度。
33.根据权利要求1-32所述的方法，其中无定形固体层具有至少95％的纯度。
34.根据权利要求1-33所述的方法，还包括研磨或刻蚀无定形固体层的表面以去除层中的变形。
35.根据权利要求1-34所述的方法，还包括实时监测无定形固体层的形成。
36.根据权利要求35所述的方法，其中监测步骤使用微尺或可见光或红外线检测池来完成。
37.根据权利要求1-36所述的方法，还包括使用质谱分离分析物颗粒并使用所述分离的分析物颗粒形成分析物束的步骤。
38.一种制备用于冷冻电子显微镜(cryo-EM)样品的方法，包括以下步骤：
a)形成水分子的分子束；
b)在真空下使基体表面与分子水束接触，其中基体表面处于-100℃或更低的温度，从而在基体表面上形成无定形冰层，其中沉积的冰层具有2微米...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·库恩，M·韦斯特法尔，
申请(专利权)人：威斯康星校友研究基金会，
类型：发明
国别省市：美国;US
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