一种利用β-葡萄糖苷酶制备宝藿苷I的方法技术

一种制备宝藿苷I的方法，包括利用β‑葡萄糖苷酶催化底物水解制备宝藿苷I，所述底物为淫羊藿提取物、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定C、箭藿苷A和箭藿苷B中的任意一种或多种，所述β‑葡萄糖苷酶由来源于极端栖热袍菌Thermotoga petrophila RKU‑1的β‑葡萄糖苷酶基因编码。

Preparation of pogoside I by \u03b2 - glucosidase

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】[根据细则37.2由ISA制定的专利技术名称]　一种利用β-葡萄糖苷酶制备宝藿苷I的方法
本专利技术涉及生物工程
，特别涉及一种利用生物酶催化技术制备宝藿苷Ⅰ的方法。
技术介绍
宝藿苷Ⅰ是淫羊藿中的一种多羟基黄酮类单体化合物，也是淫羊藿药材中的一种有效成分。淫羊藿为小檗科淫羊藿属多年生草本植物，是具有两千多年用药历史的传统中药。现代药理研究表明，淫羊藿具有增强免疫力、改善心血管系统功能、抗炎、抗肿瘤、促进骨细胞增殖等药理作用，具有广阔的用药前景。淫羊藿中最为重要的药效成分是黄酮类化合物，包括淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、箭藿苷A、箭藿苷B、宝藿苷Ⅰ等200多种成分，称为淫羊藿总黄酮。采用现代中药提取技术将淫羊藿总黄酮从淫羊藿药材中提取出来，得到淫羊藿提取物，逐渐成为众多中药制剂的重要原料。近年来，国内外研究发现，宝藿苷Ⅰ的药理活性独特，对癌细胞具有显著的抑制作用，并可诱导癌细胞凋亡，其抗癌活性和生物药剂学性质明显优于淫羊藿中其他黄酮类化合物。同时，药代动力学研究发现，淫羊藿苷在被人体吸收之前，已经在肠道中代谢成了淫羊藿素和宝藿苷I，吸收并进入血液循环发挥药理效应的物质主要是能更好被机体吸收的宝藿苷Ⅰ。因此，宝藿苷Ⅰ单体的制备和获取逐渐成为广大研究者关注的重点。宝藿苷Ⅰ可以从淫羊藿药材中直接提取，然而研究发现，淫羊藿中以淫羊藿苷的含量最多，朝藿定(A、B、C)的含量次之，而宝藿苷Ⅰ的含量极低，只有约0.17mg/g，并且宝藿苷Ⅰ与淫羊藿中的很多成分的结构和极性相近，这使得通过从淫羊藿药材中分离得到宝藿苷Ⅰ单体的难度极大，并且步骤繁琐，产率较低，不适于工业化应用。现有的制备宝藿苷Ⅰ的途径多采用生物酶(如β-葡萄糖苷酶、纤维素酶等)水解淫羊藿苷的方法制备，如中国专利技术专利申请CN 103160553 A、CN 102311985 A和CN 106148454 A都是以高纯度淫羊藿苷为底物制备宝藿苷Ⅰ。可是淫羊藿苷单体的价格较高，从而导致制备成本较高。为克服淫羊藿苷价格较高的问题，又有采用直接以淫羊藿提取物(淫羊藿总黄酮)为底物，用生物酶催化制备宝藿苷Ⅰ的方法。但是此种制备方法通常也只是将淫羊藿提取物中的淫羊藿苷转化成宝藿苷Ⅰ，而不能同时将淫羊藿提取物中的其他某些成分也转化成宝藿苷Ⅰ，从而使得淫羊藿提取物没有达到最大限度的有效利用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决上述
技术介绍
中提到的现有生物酶催化淫羊藿提取物制备宝藿苷Ⅰ的方法所存在的未能对淫羊藿提取物达到最大限度的有效利用的技术问题，提供一种酶法制备宝藿苷Ⅰ的新方法，该方法不仅能够将淫羊藿提取物中的淫羊藿苷转化成宝藿苷Ⅰ，而且能同时将淫羊藿提取物中的其他某些成分也转化成宝藿苷Ⅰ，提高了淫羊藿提取物的利用率，降低了宝藿苷Ⅰ的制备成本。为实现上述目的，专利技术人经过长期大量的实验摸索，在筛选了几十种不同来源的β-葡萄糖苷酶后，终于筛选出一种可同时将淫羊藿提取物中的多种成分转化成宝藿苷Ⅰ的β-葡萄糖苷酶。基于此，本专利技术一方面提供了一种新的制备宝藿苷Ⅰ的方法，具体为，用β-葡萄糖苷酶催化底物水解制备宝藿苷Ⅰ，所述底物为淫羊藿提取物、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、箭藿苷A和箭藿苷B中的任意一种或多种，所述β-葡萄糖苷酶由来源于极端栖热袍菌Thermotoga petrophila RKU-1的β-葡萄糖苷酶基因编码，且所述β-葡萄糖苷酶特异性地将所述淫羊藿提取物中的淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、箭藿苷A和箭藿苷B全部水解成宝藿苷Ⅰ，并将所述淫羊藿提取物中的朝藿定C水解成宝藿苷Ⅰ和鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ。淫羊藿提取物是指淫羊藿的干燥茎叶经加工制成的乙醇提取物，以淫羊藿中的黄酮类化合物为主要成分为，又名淫羊藿总黄酮。本专利技术提供的制备宝藿苷Ⅰ的方法适用于淫羊藿苷的含量范围为10％-50％的淫羊藿提取物。具体地，所述β-葡萄糖苷酶具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。优选地，所述β-葡萄糖苷酶具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。具体地，所述用β-葡萄糖苷酶催化底物水解制备宝藿苷Ⅰ的反应体系中还含有缓冲液和助溶剂，所述缓冲液的pH值为5.0-7.0，反应过程中控制反应体系的温度为45℃-80℃，pH值为4.5-6.5，反应时间为2-10h。优选地，反应过程中控制反应体系的温度为45℃-60℃，pH值为4.5-6.0，反应时间为6-10h。优选地，所述缓冲液的用量为占总反应液的60％-90％(v/v)，所述助溶剂的用量为占总反应液的5％-20％(v/v)。优选地，所述缓冲液为醋酸盐缓冲液。优选地，所述助溶剂选自丙酮、甲醇、乙醇、NMP、吐温20和吐温80中的任意一种。更优选地，所述助溶剂为丙酮，相比较选用甲醇、乙醇、NMP、吐温20或吐温80作为助溶剂时，选用丙酮具有后处理操作(即酶催化反应结束后从酶催化反应液中分离宝藿苷Ⅰ的操作)简单的优点。上述方法中所使用的β-葡萄糖苷酶的具体存在形式包括液态酶液、固态以及各种固定化酶，可以是未经纯化的粗酶形式，也可以是经部分纯化或完全纯化的形式。优选地，所述β-葡萄糖苷酶以粗酶液的形式投加，所述粗酶液是指由含有所述β-葡萄糖苷酶基因的微生物菌株诱导表达后经破胞、离心去除沉淀后获得的含有β-葡萄糖苷酶的溶液。优选地，所述粗酶液的用量为占总反应液的5％-20％(v/v)，所述底物浓度为占总反应液的5％-20％(wv)。具体地，所述粗酶液的制备过程包括：构建含有所述β-葡萄糖苷酶基因的重组质粒，并将所述重组质粒转入微生物菌株体内，培养所述微生物菌株并进行诱导表达所述β-葡萄糖苷酶，之后收集所述微生物菌株于缓冲液中，经破胞、离心去除沉淀后即得所述粗酶液。优选地，所述微生物菌株为大肠杆菌Rosetta(DE3)。待所述用β-葡萄糖苷酶催化底物水解制备宝藿苷Ⅰ的反应结束后，需要将宝藿苷Ⅰ单体从酶催化反应液中分离出来，优选将获得的酶催化反应液进行结晶工艺处理，收集结晶体即得宝藿苷Ⅰ粗品，为提高宝藿苷Ⅰ的纯度，优选将所述宝藿苷Ⅰ粗品进行重结晶工艺处理，收集结晶体即得宝藿苷Ⅰ精制品。具体地，当助溶剂为丙酮时，所述结晶工艺处理过程包括：将所述酶催化反应液于45-55℃水浴环境中减压蒸馏出丙酮，至9/10的丙酮被蒸馏出后，再将剩余溶液降温至10-15℃，待结晶体全部析出后过滤，滤饼经水洗、干燥处理后即得宝藿苷Ⅰ粗品。优选地，上述降温过程保持在水浴环境中进行。优选地，所述干燥处理是指将滤饼置于70℃烘箱中干燥至宝藿苷Ⅰ粗品中的水分含量低于5％，干燥时间优选为12h。具体地，所述重结晶工艺处理过程包括：将所述宝藿苷Ⅰ粗品溶解于无水乙醇中，并加入活性炭，搅拌并加热至55-65℃，趁热过滤，并用无水乙醇冲洗滤饼，滤液经减压蒸馏出乙醇后再加水，优选待蒸馏出50％-70％的乙醇后加水，整个过程维持温度在55-65℃，之后降温至5-10℃，搅拌至结晶体全部析出后，过滤，滤饼经乙醇溶液冲洗、干燥处理后即得宝藿苷Ⅰ精制品。...

【技术保护点】
一种制备宝藿苷Ⅰ的方法，其特征在于：用β-葡萄糖苷酶催化底物水解制备宝藿苷Ⅰ，所述底物为淫羊藿提取物、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、箭藿苷A和箭藿苷B中的任意一种或多种，所述β-葡萄糖苷酶由来源于极端栖热袍菌Thermotoga petrophila RKU-1的β-葡萄糖苷酶基因编码，且所述β-葡萄糖苷酶特异性地将所述淫羊藿提取物中的淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、箭藿苷A和箭藿苷B全部水解成宝藿苷Ⅰ，并将所述淫羊藿提取物中的朝藿定C水解成宝藿苷Ⅰ和鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】一种制备宝藿苷Ⅰ的方法，其特征在于：用β-葡萄糖苷酶催化底物水解制备宝藿苷Ⅰ，所述底物为淫羊藿提取物、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、箭藿苷A和箭藿苷B中的任意一种或多种，所述β-葡萄糖苷酶由来源于极端栖热袍菌Thermotoga petrophila RKU-1的β-葡萄糖苷酶基因编码，且所述β-葡萄糖苷酶特异性地将所述淫羊藿提取物中的淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、箭藿苷A和箭藿苷B全部水解成宝藿苷Ⅰ，并将所述淫羊藿提取物中的朝藿定C水解成宝藿苷Ⅰ和鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ。


根据权利要求1所述的制备宝藿苷Ⅰ的方法，其特征在于：所述β-葡萄糖苷酶具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。


根据权利要求1所述的制备宝藿苷Ⅰ的方法，其特征在于：所述β-葡萄糖苷酶具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。


根据权利要求1、2或3所述的制备宝藿苷Ⅰ的方法，其特征在于：所述用β-葡萄糖苷酶催化底物水解制备宝藿苷Ⅰ的反应体系中还含有缓冲液和助溶剂，所述缓冲液的pH值为5.0-7.0，反应过程中控制反应体系的温度为45℃-80℃，pH值为4.5-6.5，反应时间为2-10h。


根据权利要求4所述的制备宝藿苷Ⅰ的方法，其特征在于：所述缓冲液的用量为占总反应液的60％-90％(v/v)，所述助溶剂的用量为占总反应液的5％-20％(v/v)。


根据权利要求4所述的制备宝藿苷Ⅰ的方法，其特征在于：所述助溶剂选自丙酮、甲醇、乙醇、NMP、吐温20和吐温80中的任意一种。


根据权利要求1、2或3所述的制备宝藿苷Ⅰ的方法，其特征在于：所述β-葡萄糖苷酶以粗酶液的形式投加，所述粗酶液是指由含有所述β-葡萄糖苷酶基因的微生物菌株诱导表达后经破胞、离心去除沉淀后获得的含有β-葡萄糖苷酶的溶液。


根据权利要求7所述的制备宝藿苷Ⅰ的方法，其特征在于，所述粗酶液的制备过程包括：构建含有所述β-葡萄糖苷酶基因的重组质粒，并将所述重组质粒转入微生物菌株体内，培养所述微生物菌株并进行诱导表达所述β-葡萄糖苷酶，之后收集所述微生物菌株于缓冲液中，经破胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅荣昭，刘立辉，刘滔滔，曹磊，郭杏林，
申请(专利权)人：邦泰生物工程深圳有限公司，江西邦泰绿色生物合成生态产业园发展有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44