钝鳞紫背苔黄酮糖基转移酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术提供一种钝鳞紫背苔黄酮糖基转移酶及其编码基因与应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明专利技术首次从钝鳞紫背苔克隆得到1个可以催化黄酮醇、黄酮、二氢黄酮的7位羟基糖基化的糖基转移酶PaUGT1，体外酶活功能鉴定证明PaUGT1具有广谱的催化活性，能够催化黄酮醇类、黄酮类、二氢黄酮类以及二羟基查尔酮类化合物糖苷化。其对黄酮醇(槲皮素、山奈酚)，黄酮(芹菜素，木犀草素)等化合物的催化效率较高，可用于生物合成这些化合物的7‑O糖基化产物。

Flavone glycosyltransferase and its coding gene and its application

【技术实现步骤摘要】
钝鳞紫背苔黄酮糖基转移酶及其编码基因与应用
本专利技术属于基因工程和酶工程
，具体涉及一种钝鳞紫背苔黄酮糖基转移酶及其编码基因与应用。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。黄酮类化合物是广泛存在于自然界中的一种植物次级代谢产物，在植物体内大部分以苷的形式存在。现代研究表明黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗凝血、改善糖和脂类代谢、保护心脑血管系统等重要药用价值。糖基化可以改变植物黄酮类化合物的生理特性和化学活性，比如提高被修饰化合物的生物活性、稳定性、水溶性等。植物体内的黄酮类化合物的糖基化是由糖基转移酶(glycosyltransferase,GT,EC2.4.x.y)催化的，它们将糖基从活化的糖基供体转移到糖基受体，并形成糖苷键，一般具有较高的特异性。黄酮糖苷类天然产物多是从植物中分离得到，从植物中提取工艺流程复杂，分离纯化困难使得大规模制备受到限制，且化学合成糖苷涉及区域选择性苷化和立体选择性苷化等原因合成产率较低。糖基转移酶在体外酶活反应时需要提供昂贵的糖供体，而相比之下，利用工程微生物(比如大肠杆菌、酵母)进行体内糖基化可以获得源源不断的UDP糖分子供体。近年来已经通过该方法合成各种类型的黄酮糖苷。目前黄酮醇7-O葡萄糖苷的生物合成研究鲜有报道且黄酮7-O葡萄糖苷(芹菜素-7-O-葡萄糖苷和木樨草素-7-O-葡萄糖苷)的产量相对较低。因此，筛选具有7-O糖基化功能的UGT，阐明它的催化活性，并将其用于黄酮糖苷的合成生物学研究具有重要的意义。已研究的糖基转移酶多数来源于含有维管植物的高等植物，而苔藓植物中的糖基转移酶极少被鉴定。钝鳞紫背苔(Plagiochasmaappendiculatum)是一种苔类植物，是从水生到陆生的过渡类型，为了适应干旱的陆地环境，其体内合成丰富的次级代谢产物(包括联苄、萜类和黄酮类化合物等)。目前，钝鳞紫背苔中不同类别的黄酮已经被分离鉴定，但是对苔类植物中催化黄酮糖苷生成的糖基转移酶(GTs)的研究尚未报道。
技术实现思路
基于上述现有技术的不足，本专利技术提供一种钝鳞紫背苔黄酮糖基转移酶及其编码基因与应用。经研究发现，本专利技术得到的来自于苔类植物钝鳞紫背苔的糖基转移酶，该酶是能够高效催化黄酮7位羟基糖基化的糖基转移酶，可用于大肠杆菌生物合成黄酮类化合物7-O糖苷，因此具有较高的经济价值。为实现上述技术目的，本专利技术采用技术方案如下：本专利技术的第一个方面，提供一种名为PaUGT1的蛋白质，所述名为PaUGT1的蛋白质来源于钝鳞紫背苔(Plagiochasmaappendiculatum)。经试验验证，其具有具有催化黄酮7位羟基糖基化的功能。本专利技术的又一具体实施方式中，所述PaUGT1是如下(a1)或(a2)：(a1)SEQIDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同糖基转移酶功能的由其衍生的蛋白质。其中，SEQIDNo.1由469个氨基酸残基组成。本专利技术的又一具体实施方式中，提供一种编码所述PaUGT1的基因。其中，所述基因具有(b1)-(b3)中任一所述核苷酸序列：(b1)SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；(b2)与(b1)互补的核苷酸序列；(b3)与(b1)或(b2)所示的核苷酸序列具有≥90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(完全)序列)一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。其中，SEQIDNo.2由1410个核苷酸组成，其中第1-1407为编码序列，第1408-1410位核苷酸转录为终止密码子终止肽链合成。本专利技术的第二个方面，含有所述基因的重组表达载体、表达盒、重组细胞或转化体亦在本专利技术的保护范围之内。本专利技术的又一具体实施方式中，所述重组表达载体为重组原核表达载体，所述重组原核表达载体包括在表达载体pET32a和pETDuet中插入上述编码基因后所得。本专利技术的又一具体实施方式中，所述重组细胞为原核细胞，优选为细菌，进一步选自大肠杆菌、芽孢杆菌等；更进一步的，所述重组细胞为含有上述基因和/或重组表达载体的BL21(DE3)。本专利技术的又一具体实施方式中，所述转化体包括原核生物。本专利技术的第三个方面，所述蛋白质PaUGT1作为糖基转移酶的应用也应在本专利技术的保护范围之内。本专利技术的第四个方面，所述编码基因、重组表达载体、表达盒、重组细胞或转化体在制备PaUGT1中的应用也在本专利技术的保护范围之内。本专利技术的第五个方面，提供用于扩增上述编码基因的引物对，其核苷酸序列分别如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示。本专利技术的第六个方面，提供所述蛋白质PaUGT1具有如下(d1)或(d2)中的应用：(d1)催化黄酮醇类、黄酮类、二氢黄酮类和二羟基查尔酮类化合物糖苷化；(d2)制备黄酮醇糖苷类、黄酮糖苷类、二氢黄酮糖苷类和二羟基查尔酮糖苷类化合物。本专利技术的又一具体实施方式中，所述黄酮醇糖苷类化合物包括但不限于槲皮素-7-O-葡萄糖苷和山柰酚-7-O-葡萄糖苷；所述黄酮糖苷类化合物包括但不限于芹菜素-7-O-葡萄糖苷和木樨草素-7-O-葡萄糖苷。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的PaUGT1是首次发现的在钝鳞紫背苔中能够催化黄酮类化合物糖基化的一个7-O糖基转移酶，本专利技术利用PCR技术从cDNA获得了基因的全长序列。通过构建pET32a蛋白表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导、纯化得到目的蛋白。体外酶活功能鉴定证明PaUGT1具有广谱的催化活性，能够催化黄酮醇类、黄酮类、二氢黄酮类以及二羟基查尔酮类化合物糖苷化。其对黄酮醇(槲皮素、山奈酚)，黄酮(芹菜素，木犀草素)等化合物的催化效率较高，可用于生物合成这些化合物的7-O糖基化产物，因此具有较高的经济价值和广阔的应用前景。附图说明构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。图1：目的基因PaUGT1的ORF扩增产物的电泳图。图2：PaUGT1蛋白SDS-PAGE电泳图；其中：M:蛋白分子质量标准泳道1：PaUGT1蛋白上清；泳道2：PaUGT1蛋白纯化。图3：PaUGT1酶活催化反应的HPLC图谱及产物的鉴定的质谱图谱。反应底物分别为(A)槲皮素、(B)山柰酚、(C)芹菜素、(D)木樨草素、(E)柚皮素、(F)根皮素。其中：a：槲皮素-7-O-葡萄糖苷；b：槲皮素-3-O-葡萄糖苷；c：山柰酚-7-O-葡萄糖苷；d：山柰酚-3-O-葡萄糖苷；e：芹菜素-7-O-葡萄糖苷；f：木樨草素-7-O-葡萄糖苷；g：柚皮素-7本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质PaUGT1，其特征在于，所述蛋白质PaUGT1是如下(a1)或(a2)：/n(a1)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；/n(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同糖基转移酶功能的由其衍生的蛋白质。/n

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质PaUGT1，其特征在于，所述蛋白质PaUGT1是如下(a1)或(a2)：
(a1)SEQIDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同糖基转移酶功能的由其衍生的蛋白质。


2.编码权利要求1所述PaUGT1的基因。


3.如权利要求2所述基因，其特征在于，所述基因具有(b1)-(b3)中任一所述核苷酸序列：
(b1)SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；
(b2)与(b1)互补的核苷酸序列；
(b3)与(b1)或(b2)所示的核苷酸序列具有≥90％一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。


4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、重组细胞或转化体；
优选的，
所述重组表达载体为重组原核表达载体；进一步优选的，所述重组原核表达载体包括在表达载体pET32a和pETDuet中插入编码基因后所得；
所述重组细胞为原核细胞，优选为细菌，进一步选自大肠杆菌、芽孢杆菌等；更进一步的，所述重...

【专利技术属性】
技术研发人员：程爱霞，朱婷婷，倪荣，娄红祥，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37