一种紫菜功能基因沉默的方法及其应用技术

本发明专利技术属于海洋生物领域，具体涉及一种紫菜功能基因沉默的方法及其应用。利用In‑fusion反应，将紫菜功能基因CDS的片段反向连接至空干扰重组载体的启动子和终止子之间，将其导入大肠杆菌感受态DH5α菌株，通过氨苄霉素100mg/l筛选出阳性克隆，通过摇菌提质粒获得足量重组干扰质粒进行后续实验。本发明专利技术可获得较多纯系功能基因沉默突变株，为研究紫菜以及其他大型藻类的基因功能和分子机制提供了一套可行的实验方案。

A method of functional gene silencing in Porphyra and its application

【技术实现步骤摘要】
一种紫菜功能基因沉默的方法及其应用
本专利技术属于海洋生物领域，具体涉及一种紫菜功能基因沉默的方法及其应用。
技术介绍
RNA干扰技术能够特异性的剔除或者关闭特定基因的表达，在研究基因功能方面有着广泛的应用。潮间带红藻条斑紫菜是一种重要的经济红藻，并有望成为大型藻类的模式物种。但是针对条斑紫菜的转基因体系尚不成熟，虽有报告基因成功转入的事例，但是对功能基因的沉默与过表达，依旧处于摸索阶段。在重组质粒构建方面，传统双酶切的方法因为酶切位点问题，在质粒改造与重组中存在很多限制。在突变株的筛选方面，由于条斑紫菜的抗逆性强，当用潮霉素抗性进行筛选时，需要施加高浓度的潮霉素(1mg/ml)，同时培养周期得达到4周以上，才能将野生型杀死，当使用大体积(≥100ml)培养时,会消耗大量的潮霉素。此外，当使用锥形瓶或细胞培养瓶进行培养时，一方面不利于观察，另一方面，不利于及时挑取出单株存活的小叶状体，使得后期获得的突变材料有可能不纯。目前，尚未有利用转基因技术使条斑紫菜功能基因沉默的成功案例，在已有的条斑紫菜转基因案例中，筛选模式较为粗放，很难保证筛选出纯系突本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种紫菜功能基因沉默的方法，其特征在于：利用In-fusion反应，将紫菜功能基因CDS的片段反向连接至空干扰重组载体的启动子和终止子之间，将其导入大肠杆菌感受态DH5α菌株，通过氨苄霉素100mg/l筛选出阳性克隆，通过摇菌提质粒获得足量重组干扰质粒进行后续实验。/n

【技术特征摘要】
1.一种紫菜功能基因沉默的方法，其特征在于：利用In-fusion反应，将紫菜功能基因CDS的片段反向连接至空干扰重组载体的启动子和终止子之间，将其导入大肠杆菌感受态DH5α菌株，通过氨苄霉素100mg/l筛选出阳性克隆，通过摇菌提质粒获得足量重组干扰质粒进行后续实验。


2.按权利要求1所述的紫菜功能基因沉默的方法，其特征在于：所述空干扰重组载体为潮霉素抗性基因的载体；所述载体的目标干扰片段的启动子为PyAct1，终止子为NOS。


3.按权利要求1所述的紫菜功能基因沉默的方法，其特征在于：所述紫菜功能基因CDS的片段为紫菜功能基因的CDS靠近起始密码子ATG端150-200bp的片段的反向序列，插入至启动子与终止子之间。


4.按权利要求1所述紫菜功能基因沉默的方法，其特征在于：所述紫菜功能基因为3-脱氢喹酸合酶/O-甲基转移酶融合蛋白基因(PyAB)、条斑紫菜核糖5磷酸异构酶(PyR5PI)或条斑紫菜β胡萝卜素羟化酶(PyHY)。


5.按权利要求1-4任意一项所述紫菜功能基因沉默的方法，其特征在于：将构建成功的干扰重组质粒包裹于金粉粒子上，利用基因枪...

【专利技术属性】
技术研发人员：王广策，何帮翔，郑阵兵，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37