一种短花柱番茄的创制方法技术

本发明专利技术公开了一种短花柱番茄的创制方法，该方法使用CRISPR/Cas9系统将番茄PS‑2基因第5外显子或第6外显子进行突变敲除，得到的突变株的花柱变短，明显提高了去雄的效率。

A method of making tomato with short style

【技术实现步骤摘要】
一种短花柱番茄的创制方法
本专利技术属于作物育种
，涉及一种短花柱番茄的创制方法，特别涉及一种用CRISPR/Cas9系统敲除PS-2基因创制番茄短花柱种质的方法。
技术介绍
番茄(Solanumlycopersicum)为完全花，为自花授粉作物，而生产上销售的番茄种子均为杂种一代(F1代)。生产番茄杂交种子时，必须经过人工去雄操作。去雄时，一般操作为用镊子等工具将花蕾花瓣分开，然后将雄蕊去除。由于番茄花器较小，操作困难，费时费力。提高番茄去雄效率，即可很大程度上提高番茄杂交制种效率，降低制种成本。缩短柱头有助于提高去雄效率。如果将柱头短缩，在去雄时可用手直接捏住花蕾顶端，将花瓣和花药快速拔出而不会伤害柱头(野生型番茄柱头一般与花药筒平齐或略低，这种操作会将柱头损伤而导致无法授粉结籽)。参考文献：LDeng,HWang,etal.,2017.Efficientgenerationofpink-fruitedtomatoesusingCRISPR/Cas9system.JournalofGeneticsandGenomics.1-4.doi.org/10.1016/j.jgg.2017.10.002.BenoitGorguet,etal.,2017.ps-2,thegeneresponsibleforfunctionalsterilityintomato,duetonon-dehiscentanthers,istheresultofamutationinanovelpolygalacturonasegene.TheorApplGenet(2009)118:1199–1209.DOI10.1007/s00122-009-0974-9.
技术实现思路
本专利技术通过CRISPR/Cas9技术敲除PS-2基因获得了花柱变短的番茄突变体。较为具体地，本专利技术第一方面提供了一种短花柱番茄的创制方法，所述方法为敲除番茄PS-2基因或其保持多聚半乳糖醛酸酶活性编码能力的同源基因。在一些实施方式中，所述番茄种质为：TB0993。在一些实施方式中，所述番茄PS-2基因的编码序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术所述保持多聚半乳糖醛酸酶活性编码能力的同源基因包括但不限于：在包括番茄TB0993品种在内的番茄品种中与编码序列如SEQIDNO.1所示的基因或GenBank登录号为：EU111748的PS-2基因同源且保持多聚半乳糖醛酸酶活性的编码能力的同源基因，或者保持多聚半乳糖醛酸酶活性的编码能力的前述同源基因的突变体(突变类型包括但不限于：插入、缺失、变异、片段易位、片段融合；突变途径包括但不限于杂交种、天然突变株/种或人工突变株/种；突变位点或区域包括但不限于内含子区、外显子区、非编码区)。在一些实施方式中，所述番茄PS-2基因或其保持多聚半乳糖醛酸酶活性编码能力的同源基因编码的蛋白质序列如SEQIDNO.3所示。在一些实施方式中，所述方法为将敲除所述番茄PS-2基因或其保持多聚半乳糖醛酸酶活性编码能力的同源基因的番茄突变体制备成突变纯合体。在一些实施方式中，所述方法为敲除番茄PS-2基因或其保持多聚半乳糖醛酸酶活性编码能力的同源基因的第5外显子。在一些实施方式中，所述方法为敲除番茄PS-2基因或其保持多聚半乳糖醛酸酶活性编码能力的同源基因的第6外显子。在一些实施方式中，所述方法为将所述番茄PS-2基因或其保持多聚半乳糖醛酸酶活性编码能力的同源基因的核酸编码序列突变成如SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10中任一种所示的核酸序列或其组合。在一些实施方式中，所述方法为将所述番茄PS-2基因或其保持多聚半乳糖醛酸酶活性编码能力的同源基因编码的蛋白序列突变成如SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11中任一种所示的蛋白序列或其组合。在一些实施方式中，敲除所述番茄PS-2基因或其保持多聚半乳糖醛酸酶活性编码能力的同源基因是使用CRISPR/Cas9系统实现的。在一些实施方式中，所述CRISPR/Cas9系统中表达sgRNA的载体中靶序列如SEQIDNO.4和/或SEQIDNO.5所示。本专利技术第二方面提供了一种用于实现如本专利技术第一方面所述的创制方法或制备通过本专利技术第一方面所述的创制方法制备得到的番茄品种的sgRNA。本专利技术第三方面提供了一种用于实现如本专利技术第一方面所述的创制方法，或制备通过本专利技术第一方面所述的创制方法制备得到的番茄品种的表达sgRNA的载体。本专利技术第四方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒中含有本专利技术第二方面所述的sgRNA，或本专利技术第三方面所述的表达sgRNA的载体。本专利技术第五方面提供了一种突变蛋白，所述突变蛋白为通过本专利技术第一方面的创制方法制备的突变株中突变后PS-2基因或其保持多聚半乳糖醛酸酶活性编码能力的同源基因编码的突变蛋白。在一些实施方式中，所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10中任一种所示或其组合。本专利技术第六方面提供了一种基因，所述基因的编码序列能够编码如本专利技术第五方面所述的突变蛋白。在一些实施方式中，所述基因的编码序列如SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11中任一种所示或其组合。本专利技术第七方面提供了本专利技术第一方面所述的创制方法、如本专利技术第二方面所述的sgRNA、如本专利技术第三方面所述的表达sgRNA的载体、如本专利技术第四方面所述的试剂盒、本专利技术第五方面所述的突变蛋白或如本专利技术第六方面所述的基因在构建番茄花柱缩短的制种中的用途。相比现有技术，本专利技术的有益效果如下：本专利技术通过CRISPR/Cas9敲除番茄PS-2基因，创制出短柱头突变体材料。这种创制短柱头突变体材料的方法将在番茄制种中具有应用前景。本专利技术通过CRISPR/Cas9敲除PS-2基因获得短柱头材料，可以简化人工去雄操作，提高制种效率，降低制种成本。这种获得突变体材料的技术方法可快速有效地创制短柱头突变体，有望在制种上获得广泛应用。附图说明图1为本专利技术的PS-2基因上的CRISPR/Cas9敲除靶点序列Guide1和Guide2示意图。图2为CRISPR/Cas9敲除PS-2基因靶点序列Guide1和Guide2获得的突变体序列示意图。图3为野生型材料TB0993初开期花朵照片。图4为突变体#1初开期花朵照片。图5中左图为野生型材料TB0993盛开期花朵照片，右图为突变体#1盛开期花朵照片。图6中左图为野生型材料TB0993盛开期花朵照片，右图为突变体#1盛开期花朵照片。图7为野生型材料TB0993植株照片。图8为突变体#1植株照片。图9中左图为野生型材料TB0993叶片照片。右图为突变体#1叶片照片。图10为野生型番茄花去雄方法示意图。图11为突变体#1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种短花柱番茄的创制方法，/n所述方法为敲除番茄PS-2基因或其保持多聚半乳糖醛酸酶活性编码能力的同源基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种短花柱番茄的创制方法，
所述方法为敲除番茄PS-2基因或其保持多聚半乳糖醛酸酶活性编码能力的同源基因。


2.如权利要求1所述的创制方法，其特征在于：
所述番茄种质为：TB0993；
优选，所述番茄PS-2基因的编码序列如SEQIDNO.1所示；
优选，所述番茄PS-2基因或其保持多聚半乳糖醛酸酶活性编码能力的同源基因编码的蛋白质序列如SEQIDNO.3所示；
优选，所述创制方法为将敲除所述番茄PS-2基因或其保持多聚半乳糖醛酸酶活性编码能力的同源基因的番茄突变体制备成突变纯合体。


3.如权利要求1或2所述的创制方法，其特征在于：
所述方法为敲除番茄PS-2基因或其保持多聚半乳糖醛酸酶活性编码能力的同源基因的第5外显子；
优选，所述方法为敲除番茄PS-2基因或其保持多聚半乳糖醛酸酶活性编码能力的同源基因的第6外显子；
优选，所述方法为将所述番茄PS-2基因或其保持多聚半乳糖醛酸酶活性编码能力的同源基因的核酸编码序列突变成如SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10中任一种所示的核酸序列或其组合；
优选，所述方法为将所述番茄PS-2基因或其保持多聚半乳糖醛酸酶活性编码能力的同源基因编码的蛋白序列突变成如SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11中任一种所示的蛋白序列或其组合。


4.如权利要求1-3中任一种所述的创制方法，其特征在于：
敲除所述番茄PS-2基因或其保持多聚半乳糖醛酸酶活性编码能力的...

【专利技术属性】
技术研发人员：周明，李常保，李传友，邓磊，李保思，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11