【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】比率荧光成像方法交叉引用本申请要求于2017年4月7日提交的第62/483,004号美国临时申请的权益，该临时申请通过引用并入本文。
技术实现思路
本文公开了使用荧光比率和强度阈值检测并可视化生物样本中的生物活性区域的方法，该方法包括：a)使生物样本与所述生物活性的比率荧光指示剂接触；b)为所述生物样本捕获在第一发射波长的第一荧光强度图像和在第二发射波长的第二荧光强度图像；c)组合所述第一荧光图像和所述第二荧光图像以创建荧光比率图像；d)使用图像分析算法处理所述荧光比率图像、第一荧光强度图像、第二荧光强度图像或其任意组合，其中所述图像分析算法：i)使用荧光比率阈值、第一荧光强度阈值、第二荧光强度阈值或其任意组合来创建所述荧光比率图像的掩模图像、所述第一荧光强度图像的掩模图像、所述第二荧光强度图像的掩模图像或其任意组合，ii)如果两个或更多个掩模图像已在步骤(i)中创建，则对所述荧光比率图像的掩模图像、所述第一荧光强度图像的掩模图像、所述第二荧光强度图像的掩模图像或其任意组合执行“与”(AND)逻辑运算，并且iii)提供所述生物样本对于所述生物活性呈阳性或阴性的分类，其中所述分类基于对所述荧光比率图像、第一荧光强度图像、第二荧光强度图像或其任意组合内的目标区域的检测，所述区域展现出的荧光比率值或荧光强度值超过所述荧光比率阈值、第一荧光强度阈值、第二荧光强度阈值或其任意组合的值，以及e)向用户显示所述荧光比率图像、第一荧光强度图像或第二荧光强度图像内的所述目标区域，以及任选地将分类结果存储在计算机存储器中。在一些实施方案中，所...
【技术保护点】
1.一种用于检测生物样本中的生物活性区域的方法，该方法包括：/na)使生物样本与所述生物活性的比率荧光指示剂接触；/nb)在第一发射波长下捕获所述生物样本的第一荧光强度图像，并且在第二发射波长下捕获所述生物样本的第二荧光强度图像；/nc)组合所述第一荧光图像和所述第二荧光图像以创建荧光比率图像；/nd)使用图像分析算法处理所述荧光比率图像、第一荧光强度图像、第二荧光强度图像或其任意组合，以检测生物活性区域，其中所述图像分析算法：/ni)使用荧光比率阈值、第一荧光强度阈值、第二荧光强度阈值或其任意组合来创建所述荧光比率图像、第一荧光强度图像、第二荧光强度图像或其任意组合的掩模图像，/nii)如果两个或更多个掩模图像已在步骤(i)中创建，则对选自所述荧光比率图像的掩模图像、所述第一荧光强度图像的掩模图像和所述第二荧光强度图像的掩模图像的两个或更多个图像执行“与”逻辑运算，并且/niii)提供所述生物样本对于所述生物活性呈阳性或阴性的分类，其中所述分类基于对步骤(i)中使用的所述荧光比率图像、第一荧光强度图像、第二荧光强度图像或其组合内目标区域的检测，所述区域展现出的荧光比率值或荧光强度值超...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170407 US 62/483,0041.一种用于检测生物样本中的生物活性区域的方法，该方法包括：
a)使生物样本与所述生物活性的比率荧光指示剂接触；
b)在第一发射波长下捕获所述生物样本的第一荧光强度图像，并且在第二发射波长下捕获所述生物样本的第二荧光强度图像；
c)组合所述第一荧光图像和所述第二荧光图像以创建荧光比率图像；
d)使用图像分析算法处理所述荧光比率图像、第一荧光强度图像、第二荧光强度图像或其任意组合，以检测生物活性区域，其中所述图像分析算法：
i)使用荧光比率阈值、第一荧光强度阈值、第二荧光强度阈值或其任意组合来创建所述荧光比率图像、第一荧光强度图像、第二荧光强度图像或其任意组合的掩模图像，
ii)如果两个或更多个掩模图像已在步骤(i)中创建，则对选自所述荧光比率图像的掩模图像、所述第一荧光强度图像的掩模图像和所述第二荧光强度图像的掩模图像的两个或更多个图像执行“与”逻辑运算，并且
iii)提供所述生物样本对于所述生物活性呈阳性或阴性的分类，其中所述分类基于对步骤(i)中使用的所述荧光比率图像、第一荧光强度图像、第二荧光强度图像或其组合内目标区域的检测，所述区域展现出的荧光比率值或荧光强度值超过步骤(i)中使用的荧光比率阈值、第一荧光强度阈值、第二荧光强度阈值或其任意组合的值，以及
iv)任选地将分类结果存储在计算机存储器中。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括显示所述荧光比率图像、所述第一荧光强度图像、所述第二荧光强度图像或其任意组合内的所述目标区域。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样本是体外生物样本或体内生物样本。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述生物样本是细胞样品、离体组织样品或体内组织样品。
5.根据权利要求1所述的方法，其中待检测的生物活性与疾病相关。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述疾病是关节炎、动脉粥样硬化、癌症、癌前病变或炎症。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
8.根据权利要求1所述的方法，其中待检测的生物活性与恶性组织或凝血(血液凝固)相关。
9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)至(d)以限定的时间间隔重复两次或更多次，以提供一系列第一荧光强度图像、第二荧光强度图像和荧光比率图像，以供监测生物活性随时间的变化。
10.根据权利要求2所述的方法，其中实时提供所述目标区域的显示。
11.根据权利要求10所述的方法，其中外科医生在术中设置中使用所述目标区域的显示来引导手术过程。
12.根据权利要求10所述的方法，其中使用内窥镜捕获所述第一荧光强度图像和所述第二荧光强度图像，并且所述目标区域的显示用来引导所述内窥镜的定位。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述比率荧光指示剂包含由可裂解的连接体隔开的荧光供体部分和荧光受体部分。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述荧光供体部分和荧光受体部分分别为Cy5和Cy7。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述可裂解的连接体包含可被蛋白酶裂解的肽键。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述蛋白酶是金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述比率荧光指示剂包含式(I)的分子：
[DA-cA]-A-[cM-M]-X-B-[cB-DB]式(I)
其中
X是可被蛋白酶裂解的可裂解的连接体，
A是具有包含5至20个酸性氨基酸残基的序列的肽，
B是具有包含5至20个碱性氨基酸残基的序列的肽，
cA、cB和cM各自独立地包含0至1个氨基酸残基，
M是大分子，并且
DA和DB是能够彼此发生荧光共振能量转移的一对受体和供体荧光部分；并且其中[cM-M]结合至A或X上的任何位置，[DA-cA]结合至A的任何氨基酸残基，且[cB-DB]结合至B的任何氨基酸残基。
18.根据权利要求17所述的方法，其中A是具有包含5至9个酸性氨基酸残基的序列的肽。
19.根据权利要求17所述的方法，其中B是具有包含7至9个碱性氨基酸残基的序列的肽。
20.根据权利要求17所述的方法，其中A是包含5或9个连续谷氨酸残基的肽序列，且B是包含8或9个连续精氨酸残基的肽序列。
21.根据权利要求17所述的方法，其中cA、cB和cM各自独立地选自D氨基酸、L氨基酸、α-氨基酸、β-氨基酸或γ-氨基酸。
22.根据权利要求17所述的方法，其中cA、cB和cM各自独立地选自具有游离巯基的任意氨基酸，具有N-末端胺基的任意氨基酸，以及具有在与羟胺或肼基反应时能够形成肟或腙键的侧链的任意氨基酸。
23.根据权利要求17所述的方法，其中cA、cB和cM各自独立地选自D-半胱氨酸、D-谷氨酸、赖氨酸和对-4-乙酰基L-苯丙氨酸。
24.根据权利要求17所述的方法，其中X包含选自以下的氨基酸序列：PLGLAG、PLG-C(me)-AG、RPLALWRS、ESPAYYTA、DPRSFL、PPRSFL、RLQLKL和RLQLK(Ac)L。
25.根据权利要求17所述的方法，其中X可被金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶裂解。
26.根据权利要求17所述的方法，其中DA和DB是Cy5和Cy7。
27.根据权利要求17所述的方法，其中DA和DB是Cy5和IRDye750。
28.根据权利要求17所述的方法，其中DA和DB是Cy5和IRDye800。
29.根据权利要求17所述的方法，其中DA和DB是Cy5和ICG。
30.根据权利要求17所述的方法，其中所述式(I)分子是SDM-25。
31.根据权利要求30所述的方法，其中仅使用荧光比率阈值创建掩模文件。
32.根据权利要求1所述的方法，其中在创建所述荧光比率图像之前，用图像曝光时间对所述第一和第二荧光强度图像进行归一化。
33.根据权利要求1所述的方法，其中目标区域内的平均荧光比率或平均荧光强度值提供了所述目标区域中的生物活性的定性或定量度量。
34.根据权利要求1所述的方法，其中所述图像处理算法进一步包括核实所检测的目标区域大于指定的最小大小。
35.一种用于自动优化用来检测生物样本的比率荧光图像中的生物活性区域的荧光比率和荧光强度阈值的方法，该方法包括：
a)提供多个生物样本；
b)使每个生物样本与所述生物活性的比率荧光指示剂接触；
c)为每个生物样本捕获在第一发射波长的第一荧光强度图像和在第二发射波长的第二荧光强度图像；
d)组合所述第一荧光图像和所述第二荧光图像以为每个生物样本创建荧光比率图像；
e)提供第一荧光强度阈值、第二荧光强...
【专利技术属性】
技术研发人员：亚历克·哈鲁图涅，杰瑟斯·E·冈萨雷斯，
申请(专利权)人：艾维拉斯生物科学公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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