一株拮抗马铃薯疮痂链霉菌的枯草芽孢杆菌制造技术

本发明专利技术公开了一株拮抗马铃薯疮痂链霉菌的枯草芽孢杆菌，属于农业环境微生物技术领域。本发明专利技术的生防枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis YPS‑7，该菌株已于2019年9月2日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2019678；该生防菌可对马铃薯疮痂链霉菌具有高效的拮抗活性，在马铃薯疮痂病的防治中具有良好的应用前景。

A Bacillus subtilis resistant to Streptomyces scab of potato

【技术实现步骤摘要】
一株拮抗马铃薯疮痂链霉菌的枯草芽孢杆菌
本专利技术涉及一株拮抗马铃薯疮痂链霉菌的枯草芽孢杆菌，属于农业环境微生物

技术介绍
马铃薯疮痂病是一种可由多种植物病原链霉菌(Steptomycesspp.)引起的经济性病害，其主要致病菌是疮痂链霉菌(Streptomycesscabies)，感病薯块表面形成不同程度的痂状病斑，严重影响薯块的经济价值，种薯感病后除直接造成经济损失外，还可加速病害的传播，该病已成为制约马铃薯生产的重要因素之一。马铃薯疮痂病是一种难防的世界性土传病害，目前对该病害还缺乏特别有效的防治方法，生产中针对该病害的主要防治方法有选用抗病品种、化学药剂防治和生物制剂防治等。其中，选用抗病品种方法具有筛选难度大、适用地区受限的缺点；而化学药剂防治方法不仅污染环境，还会使土壤的微生物生态系统失衡，不利于可持续发展。因此，有必要寻找一种有效的防治马铃薯疮痂病方法。
技术实现思路
针对马铃薯疮痂病难以防治的问题，本专利技术提供了一种生物防治马铃薯疮痂病的方法，获得一株高效拮抗马铃薯疮痂链霉菌(Streptomycesscabies)的生防枯草芽孢杆菌菌株。本专利技术的第一个目的是提供一株拮抗马铃薯疮痂链霉菌的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)YPS-7，已于2019年9月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2019678。本专利技术的第二个目的是提供含有上述枯草芽孢杆菌YPS-7的微生物制剂。在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物制剂中含有活菌数≥106CFU/g的枯草芽孢杆菌YPS-7干菌体。在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物制剂中含有活菌数≥106CFU/mL的枯草芽孢杆菌YPS-7湿菌体。本专利技术的第三个目的是提供一种拮抗马铃薯疮痂链霉菌的方法，是将上述枯草芽孢杆菌YPS-7或微生物菌剂接种至经过疮痂链霉菌(Streptomycesscabies)侵染的活体马铃薯块茎内。在本专利技术的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌或微生物菌剂中，枯草芽孢杆菌YPS-7活菌数不少于106cfu/mL。在本专利技术的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌或微生物菌剂中，枯草芽孢杆菌YPS-7活菌数不少于106cfu/g。本专利技术的第四个目的是提供上述枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌YPS-7在抑制植物病变领域中的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述植物是马铃薯。本专利技术的第五个目的是提供上述枯草芽孢杆菌在食品领域中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的BacillussubtilisYPS-7，本身分离自土壤，是土壤习居菌，采用改良牛津杯法测定抑菌圈直径，发现BacillussubtilisYPS-7对疮痂链霉菌的抑菌圈直径达29mm，拮抗能力强，防治效果良好。本专利技术的另一个优点为，采用16srDNA测序分析结合特异性PCR技术对枯草芽孢杆菌群进行鉴定，避免了培养方法和生理生化鉴定的繁琐。附图说明图1为初筛拮抗菌对疮痂链霉菌的抑菌效果图。图2为复筛拮抗菌对疮痂链霉菌的抑菌效果图(注：孔径直径为8mm，底部平板直径为85mm)。图3为本专利技术筛选方法筛选出的BacillussubtilisYPS-7在LB固体培养基的菌落形态。图4为本专利技术筛选方法筛选出的BacillussubtilisYPS-7的特异性引物PCR扩增结果。图5为本专利技术的生防菌剂BacillussubtilisYPS-7的活体防病效果结果。生物材料保藏一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，分类命名为BacillussubtilisYPS-7，已于2019年9月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2019678，保藏地址为中国武汉，武汉大学。具体实施方式以下是本专利技术的具体实施例，对本专利技术的技术方案做详细描述，但是并非用于限制本专利技术的保护范围。实施例1疮痂链霉菌拮抗菌的筛选(1)马铃薯疮痂病病原菌疮痂链霉菌孢子悬浮液的制备采用YME培养基(配方：酵母粉4g，麦芽糖提取物10g，葡萄糖4g，琼脂15g，蒸馏水定容至1L，pH7.2，121℃下湿热灭菌15min)对菌株进行活化培养5天，取10mL无菌水倾入长满病原菌的平板，玻璃棒轻刮孢子，脱脂棉除去菌丝团，滤液离心，弃上清，无菌水悬浮沉淀，使孢子浓度为105-107CFU/mL；(2)拮抗菌的分离从黑龙江省克山县马铃薯种植区疮痂病发病地块中取土样，称取1g，加入含有玻璃珠的200mL三角瓶中，加蒸馏水50mL，150r/min振荡1h。取悬浮培养液稀释成10-1，10-2，10-3后，取100μL涂布到LB固体平板上，37℃倒置静止培养24h。利用QPix420仪器挑取平板上单菌落至96深孔板，置于37℃，220r/min的多孔板摇床上培养24h。转接到新的LB固体平板进行划线培养，对获得的单克隆菌株第二次划线培养，获得纯种菌株。将获得纯培养菌株编号并溶解至30％的甘油中保藏；(3)拮抗菌的初筛菌株的抑菌效果测试采用抑菌圈法。将疮痂链霉菌制作成菌悬液，取100μL涂布到YME固体平板上，取上述待测试纯种菌株冻存液划线到涂有疮痂链霉菌的YME平板上，28℃倒置静止培养2-3天，从600株待测菌株中初筛得到30株对疮痂病链霉菌生长有拮抗作用明显的菌株。抑菌效果如图1所示，对疮痂病链霉菌生长有拮抗作用的菌株在其周围会形成透明的区域，即为透明圈，根据所产生的抑菌圈大小来判断抑菌效果。把具有抑菌圈的细菌在营养培养基(配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂15g，蒸馏水定容至1L，pH7.0，121℃下湿热灭菌15min)平板上进行划线纯化，28℃培养箱内培养48小时后，观察菌落的形态、颜色和大小性状，对具有性状不一样的菌落，分别按同样的方法再次进行划线纯化，直至每个平板上的菌落呈现相同的颜色，大小和形状，即为纯化好的细菌；(4)拮抗菌的复筛改良牛津杯法，即将素琼脂(2％琼脂)倒入平板中待其凝固，然后将平板分成4个扇形区域，用镊子把已灭菌的牛津杯放入到四个扇形区域中央，倒入YME培养基，待培养基凝固，平板中加入0.1mL疮痂链霉菌菌液，用已灭菌的玻璃株将菌液均匀打散，取出牛津杯，在原牛津杯所在的孔中加入80μL待测拮抗菌，放置于28℃进行培养24h，观察抑菌圈大小，在牛津杯中接种80mLLB液体培养基为对照，筛选拮抗活性较好的细菌，抑菌圈直径为29mm，结果见图2。拮抗菌命名为7-2。实施例2BacillussubtilisYPS-7的鉴定枯草芽孢杆菌群(Bacillussubtilisgroup)是枯草芽孢杆菌及其近缘种的总称，其包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacill本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YPS-7，已于2019年9月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019678。/n

【技术特征摘要】
1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)YPS-7，已于2019年9月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2019678。


2.含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌YPS-7的微生物制剂。


3.如权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，含有活菌数≥106CFU/g的枯草芽孢杆菌YPS-7干菌体。


4.如权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，含有活菌数≥106CFU/mL的枯草芽孢杆菌YPS-7湿菌体。


5.一种拮抗马铃薯疮痂链霉菌的方法，其特征在于，是将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌YPS-...

【专利技术属性】
技术研发人员：张娟，李江华，周英俊，陈坚，堵国成，杨佩珊，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32