一种肝脏干细胞的分离培养方法技术

本发明专利技术公开了一种肝脏干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：A、向离体肝脏注入3～5℃的保存液，使肝脏在30min内温度降低至15℃一下；B、使用缓冲液对肝脏进行冲洗20～30min；C、向肝脏开放注入灌流液，灌流液的温度为37℃，注入流速为200～300mL/min，持续2～3min；D、使用胶原酶溶液对肝脏进行浸泡消化45～60min；E、使用清洗液对肝脏进行清洗，获得肝脏干细胞悬液，离心获得肝脏干细胞；F、将获得的肝脏干细胞接入培养液进行培养，培养温度为37℃，培养时间为24～36h。本发明专利技术能够改进现有技术的不足，提高了肝脏干细胞分离培养的成功率。

A method of isolation and culture of liver stem cells

【技术实现步骤摘要】
一种肝脏干细胞的分离培养方法
本专利技术涉及生物
，尤其是一种肝脏干细胞的分离培养方法。
技术介绍
干细胞是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的原始未分化细胞，处于未定向分化状态并具有增殖能力。在特定条件下，干细胞可分化成不同类型的具有特征性形态、特异分子标志和特殊功能的成熟细胞。肝脏干细胞可以转化为新的肝脏细胞，对于严重的肝脏疾病有着非常好的治疗前景。由于肝脏干细胞含量极少，现有技术中对于肝脏细胞的分离培养成功率较低，在实验室中通常需要多次分离培养才能获得足够的肝脏干细胞。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种肝脏干细胞的分离培养方法，能够解决现有技术的不足，提高了肝脏干细胞分离培养的成功率。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案如下。一种肝脏干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：A、向离体肝脏注入3～5℃的保存液，使肝脏在30min内温度降低至15℃一下；B、使用缓冲液对肝脏进行冲洗20～30min；C、向肝脏开放注入灌流液，灌流液的温度为37℃，注入流速为200～300mL/min，持续2～3min；D、使用胶原酶溶液对肝脏进行浸泡消化45～60min；E、使用清洗液对肝脏进行清洗，获得肝脏干细胞悬液，离心获得肝脏干细胞；F、将获得的肝脏干细胞接入培养液进行培养，培养温度为37℃，培养时间为24～36h。作为优选，步骤A中，保存液采用UW液。作为优选，步骤B中，缓冲液包括以下组分，>0.35wt%的KCl、0.1wt%的CaCl2、0.55wt%的NaHCO3、0.15wt%的Na2HPO4·2H2O，余量为水。作为优选，步骤C中，灌流液包括以下组分，0.03wt%的KCl、0.01wt%的庆大霉素、0.02wt%的青霉素、0.05wt%的HEPES、0.75wt%的NaCl，余量为水。作为优选，步骤D中，胶原酶溶液包括以下组分，0.3wt%的Ⅱ型胶原酶、0.1wt%的KH2PO4、0.05wt%的MgSO4·7H2O、1.5wt%的葡萄糖，余量为水；配置完成后，通过添加柠檬酸使胶原酶溶液的pH值达到6.5～6.8。作为优选，步骤E中，清洗液包括以下组分，0.55wt%的KH2PO4、0.15wt%的MgCl2、2.5wt%的双抗、0.05wt%的HEPES，余量为水。作为优选，步骤F中，培养液包括以下组分，0.1wt%的地塞米松、0.05wt%的尼克酰胺、0.85wt%的D半乳糖、0.03wt%的双抗、0.25wt%的胰岛素，余量为UltroserG培养液。采用上述技术方案所带来的有益效果在于：本专利技术通过改进灌流操作工艺，采用“低浓度、大流量”的灌流方法，可以有效提高肝细胞的活性，然后通过酸性胶原酶溶液的消化处理，可以对肝脏干细胞进行有效分离，以达到提高干细胞培养成功率的目的。附图说明图1是实施例1中肝脏干细胞培养后的显微镜下细胞状态的照片。图2是实施例2中肝脏干细胞培养后的显微镜下细胞状态的照片。图3是实施例3中肝脏干细胞培养后的显微镜下细胞状态的照片。具体实施方式实施例1一种肝脏干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：A、向离体肝脏注入5℃的保存液，使肝脏在30min内温度降低至15℃一下；B、使用缓冲液对肝脏进行冲洗20min；C、向肝脏开放注入灌流液，灌流液的温度为37℃，注入流速为270mL/min，持续3min；D、使用胶原酶溶液对肝脏进行浸泡消化50min；E、使用清洗液对肝脏进行清洗，获得肝脏干细胞悬液，离心获得肝脏干细胞；F、将获得的肝脏干细胞接入培养液进行培养，培养温度为37℃，培养时间为30h。步骤A中，保存液采用UW液。步骤B中，缓冲液包括以下组分，0.35wt%的KCl、0.1wt%的CaCl2、0.55wt%的NaHCO3、0.15wt%的Na2HPO4·2H2O，余量为水。步骤C中，灌流液包括以下组分，0.03wt%的KCl、0.01wt%的庆大霉素、0.02wt%的青霉素、0.05wt%的HEPES、0.75wt%的NaCl，余量为水。步骤D中，胶原酶溶液包括以下组分，0.3wt%的Ⅱ型胶原酶、0.1wt%的KH2PO4、0.05wt%的MgSO4·7H2O、1.5wt%的葡萄糖，余量为水；配置完成后，通过添加柠檬酸使胶原酶溶液的pH值达到6.7。步骤E中，清洗液包括以下组分，0.55wt%的KH2PO4、0.15wt%的MgCl2、2.5wt%的双抗、0.05wt%的HEPES，余量为水。步骤F中，培养液包括以下组分，0.1wt%的地塞米松、0.05wt%的尼克酰胺、0.85wt%的D半乳糖、0.03wt%的双抗、0.25wt%的胰岛素，余量为UltroserG培养液。实施例2本实施例是在实施例1的基础上改进而来，在灌流液中，加入0.01wt%的丁二胺和0.03wt%的异甘草酸镁。通过改进灌流液的配方，可以有效提高肝脏干细胞的增殖。实施例3本实施例是在实施例2的基础上改进而来的，在胶原酶溶液内加入0.1wt%的谷胱甘肽和0.03wt%的大豆苷元。通过改进胶原酶溶液的配方，可以在消化处理过程中，减少对于干细胞的损失。使用小白鼠的肝脏依照上述三个实施例进行干细胞的分离培养实验，得到的肝脏干细胞的纯度如下表所示：组别纯度（%）实施例184.1实施例289.6实施例395.9附图1-3分别为实施例1-3培养出的肝脏干细胞的显微镜下照片，有照片可以看出，使用本专利技术分离培养的肝脏干细胞结构清晰、完整、形态正常。以上显示和描述了本专利技术的基本原理和主要特征和本专利技术的优点。本行业的技术人员应该了解，本专利技术不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本专利技术的原理，在不脱离本专利技术精神和范围的前提下，本专利技术还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本专利技术范围内。本专利技术要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肝脏干细胞的分离培养方法，其特征在于包括以下步骤：/nA、向离体肝脏注入3～5℃的保存液，使肝脏在30min内温度降低至15℃一下；/nB、使用缓冲液对肝脏进行冲洗20～30min；/nC、向肝脏开放注入灌流液，灌流液的温度为37℃，注入流速为200～300mL/min，持续2～3min；/nD、使用胶原酶溶液对肝脏进行浸泡消化45～60min；/nE、使用清洗液对肝脏进行清洗，获得肝脏干细胞悬液，离心获得肝脏干细胞；/nF、将获得的肝脏干细胞接入培养液进行培养，培养温度为37℃，培养时间为24～36h。/n

【技术特征摘要】
1.一种肝脏干细胞的分离培养方法，其特征在于包括以下步骤：
A、向离体肝脏注入3～5℃的保存液，使肝脏在30min内温度降低至15℃一下；
B、使用缓冲液对肝脏进行冲洗20～30min；
C、向肝脏开放注入灌流液，灌流液的温度为37℃，注入流速为200～300mL/min，持续2～3min；
D、使用胶原酶溶液对肝脏进行浸泡消化45～60min；
E、使用清洗液对肝脏进行清洗，获得肝脏干细胞悬液，离心获得肝脏干细胞；
F、将获得的肝脏干细胞接入培养液进行培养，培养温度为37℃，培养时间为24～36h。


2.根据权利要求1所述的肝脏干细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤A中，保存液采用UW液。


3.根据权利要求1所述的肝脏干细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤B中，缓冲液包括以下组分，
0.35wt%的KCl、0.1wt%的CaCl2、0.55wt%的NaHCO3、0.15wt%的Na2HPO4·2H2O，余量为水。


4.根据权利要求1所述的肝脏干细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤C中，灌...

【专利技术属性】
技术研发人员：王克强，
申请(专利权)人：王克强，
类型：发明
国别省市：内蒙;15