一种葡萄糖脱氢酶酶活力准确定性定量的方法技术

本发明专利技术涉及酶活力检测技术领域，具体涉及一种葡萄糖脱氢酶酶活力准确定性定量的方法。本发明专利技术首先提供一种葡萄糖脱氢酶酶促反应的产物NADPH的HPLC检测方法，所述方法采用以硅烷键合相作为固定相的反相色谱柱，流动相由缓冲盐和有机溶剂组成，紫外检测波长为330～350nm，流速为0.8～1.2mL/min；进而提供一种葡萄糖脱氢酶酶活力准确定性定量的方法。本发明专利技术检测方法操作简单，灵敏度高，准确性强，不易受到复杂样品中不溶性颗粒及一些色素的影响，且易于标准化操作。

An accurate qualitative and quantitative method for the activity of glucose dehydrogenase

【技术实现步骤摘要】
一种葡萄糖脱氢酶酶活力准确定性定量的方法
本专利技术涉及酶活力检测
，具体涉及一种葡萄糖脱氢酶酶活力准确定性定量的方法。
技术介绍
葡萄糖脱氢酶(GlucoseDehydrogenase，E.C.1.1.1.47，简称GDH)主要存在于动物的肝脏及弱氧化醋杆菌中，能催化β-D-葡萄糖，生成葡萄糖酸(D-葡萄糖酸-δ-内酯)，同时伴随着还原性辅酶NADPH的生成。早在1975年，Banauch等人将葡萄糖脱氢酶作为临床血糖测定的诊断用酶，以测定人体体液中的葡萄糖的浓度。目前，葡萄糖脱氢酶主要用于临床上血糖监测传感器和由NADP依赖的葡萄糖脱氢酶介导的NADPH再生。目前，葡萄糖脱氢酶活力主要的检测方法有分光光度法，离子色谱法、连续监测法等。分光光度法的原理是NADP+为氢受体时，葡萄糖脱氢酶能催化β-D-葡萄糖，生成葡萄糖酸(D-葡萄糖酸-δ-内酯)，同时伴随着还原性辅酶NADPH的生成，通过分光光度计可对其产生的NADPH进行定量，从而计算出葡萄糖脱氢酶的活性。此方法虽然简单易行，成本低，但是该方法易受到不溶性颗粒及样品中相关杂质的影响，从而导致结果出现较大的误差。离子色谱法的原理是葡萄糖脱氢酶能催化β-D-葡萄糖，生成葡萄糖酸，通过检测葡萄糖酸钾的量能测定出葡萄糖脱氢酶的酶活。这种方法需要用到离子色谱，而该仪器普及性差，无法满足广泛使用的需求。连续监测法主要采用自动生化仪监测反应产物NADPH随时间的变化过程，从而测定出葡萄糖脱氢酶的活性。该方法需要用到自动生化分析仪，普及性差，且对仪器各项参数、反应条件等需要考察，无法满足常规检测的要求。中国专利CN104388373A所提及的葡萄糖脱氢酶酶活力测定方法，采用分光光度法检测样品中葡萄糖脱氢酶酶促反应的产物NADPH吸光度值来测定葡萄糖脱氢酶的活力，此法易受到不溶性颗粒及样品中相关杂质的影响，导致结果误差大。中国专利CN108132318A所提及的NADPH的HPLC检测方法，采用C18柱以及梯度洗脱的方式，时间长，程序复杂。因此，建立快速、简便、直观、准确的GDH酶活力检测方法是急需解决的基础问题。本专利技术正是基于这样的目的进行了研究并提供了一种葡萄糖脱氢酶酶活力快速准确的测定方法。
技术实现思路
本专利技术要解决葡萄糖脱氢酶酶活力准确定性定量的问题，首先需解决葡萄糖脱氢酶酶促反应的产物NADPH的检测问题。为了克服现有技术中的缺点与不足，本专利技术首先提供一种NADPH的HPLC检测方法，进而提供一种葡萄糖脱氢酶酶活力准确定性定量的方法。本专利技术的方法能够快速、简便、直观、准确的检测出NADPH的量并计算出葡萄糖脱氢酶酶活力，且不易受到复杂样品中不溶性颗粒及一些色素的影响。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术提供一种测定NADPH的HPLC方法，所述方法采用以硅烷键合相作为固定相的反相色谱柱，流动相由缓冲盐和有机溶剂组成，紫外检测波长为330～350nm，流速为0.8～1.2mL/min。在本专利技术的一些实施方式中，HPLC方法使用的色谱柱是C30柱。在本专利技术的一些实施方式中，HPLC方法使用的缓冲盐选自磷酸氢二钠、乙酸钠、和磷酸钠中的一种或几种；有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈中的一种或几种；在一些实施方式中，HPLC方法使用的缓冲盐是乙酸钠，有机溶剂是甲醇。在本专利技术的一些实施方式中，HPLC方法使用的缓冲盐乙酸钠溶液的pH为5.0～6.0；在一些实施方式中，HPLC方法使用的缓冲盐乙酸钠溶液的pH为5.0；在一些实施方式中，HPLC方法使用的缓冲盐乙酸钠溶液的pH为5.5；在一些实施方式中，HPLC方法使用的缓冲盐乙酸钠溶液的pH为6.0。在本专利技术的一些实施方式中，HPLC方法使用的缓冲盐乙酸钠溶液的浓度为43～129mM；在一些实施方式中，HPLC方法使用的缓冲盐乙酸钠溶液的浓度为43mM；在一些实施方式中，HPLC方法使用的缓冲盐乙酸钠溶液的浓度为86mM；在一些实施方式中，HPLC方法使用的缓冲盐乙酸钠溶液的浓度为129mM。在本专利技术的一些实施方式中，HPLC方法使用的有机溶剂占流动相总体积的百分比为8～12％；在一些实施方式中，HPLC方法使用的有机溶剂占流动相总体积的百分比为8％；在一些实施方式中，有机溶剂占流动相总体积的百分比为10％；在一些实施方式中，有机溶剂占流动相总体积的百分比为12％。在本专利技术的一些实施方式中，HPLC方法使用的紫外检测波长为330～350nm；在一些实施方式中，HPLC方法使用的紫外检测波长为340nm；在一些实施方式中，HPLC方法使用的紫外检测波长为340nm；在一些实施方式中，HPLC方法使用的紫外检测波长为350nm。在本专利技术的一些实施方式中，HPLC方法使用的流速为0.8～1.2mL/min；在一些实施方式中，HPLC方法使用的流速为0.8mL/min；在一些实施方式中，HPLC方法使用的流速为1.0mL/min；在一些实施方式中，HPLC方法使用的流速为1.2mL/min。在本专利技术的一些实施方式中，HPLC方法使用的柱温为23～33℃；在一些实施方式中，HPLC方法使用的柱温为23℃；在一些实施方式中，HPLC方法使用的柱温为28℃；在一些实施方式中，HPLC方法使用的柱温为33℃。本专利技术还提供一种葡萄糖脱氢酶酶活力准确定性定量的方法，所述的方法采用HPLC法检测葡萄糖脱氢酶酶促反应的产物NADPH，进而计算出样品中葡萄糖脱氢酶的酶活力，具体包括如下步骤：(1)绘制NADPH峰面积—NADPH浓度的标准曲线；(2)葡萄糖脱氢酶介导的酶促反应的发生；将pH8.0Tris-HCl缓冲液、葡萄糖溶液和NADP+溶液混合均匀后，加入Tris-HCl缓冲液稀释过的葡萄糖脱氢酶样品，室温反应后，加热煮沸并冷却至室温；(3)HPLC法检测酶促反应的产物NADPH的生成量；(4)已知NADPH的生成量计算出葡萄糖脱氢酶的酶活力。在本专利技术的一些实施方式中，步骤(2)中所述的酶促反应进行前样品需先采用Tris-HCl缓冲溶液稀释至葡萄糖脱氢酶的酶活力在0.01～1.25U/mL范围内。步骤(2)中所述的室温反应时间是4min。在本专利技术的一些实施方式中，步骤(3)中所述的HPLC色谱条件为：色谱柱：C30柱(4.6*250mm)；检测波长：340nm；柱温：28℃；流速：1.0ml/min；运行时间：15min；流动相：乙酸钠溶液(pH＝5.5)和甲醇，甲醇占流动相总体积的百分比为10％。在本专利技术的一些实施方式中，步骤(4)中所述的酶活力定义为在温度为25℃和pH8.0条件下，每分钟催化葡萄糖生成1μmol的NADPH的酶量定义为一个国际单位(IU)。计算公式为：式中：A：待测液峰面积；K：标准曲线的斜率；C：标准曲线的截距；N：酶的稀释倍数；M：称取的待测酶粉重量；T：室温反应时间；U本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种NADPH的HPLC检测方法，其特征在于，采用以硅烷键合相作为固定相的反相色谱柱，流动相由缓冲盐和有机溶剂组成，紫外检测波长为330～350nm，流速为0.8～1.2mL/min。/n

【技术特征摘要】
1.一种NADPH的HPLC检测方法，其特征在于，采用以硅烷键合相作为固定相的反相色谱柱，流动相由缓冲盐和有机溶剂组成，紫外检测波长为330～350nm，流速为0.8～1.2mL/min。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反相色谱柱是C30柱。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的缓冲盐选自磷酸氢二钠、乙酸钠、和磷酸钠中的一种或几种；有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈中的一种或几种。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的缓冲盐pH为5.0～6.0。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的有机溶剂占流动相总体积的百分比为8～12％。


6.一种葡萄糖脱氢酶酶活力准确定性定量的方法，其特征在于，采用HPLC法检测葡萄糖脱氢酶酶促反应的产物NADPH，进而计算出样品中葡萄糖脱氢酶的酶活力，具体包括如下步骤：
(1)绘制NADPH峰面积—NADPH浓度的标准曲线；
(2)葡萄糖脱氢酶介导的酶促反应的发生；
将pH8.0Tris-HCl缓冲液、葡萄糖溶液和NADP+溶液混合均匀...

【专利技术属性】
技术研发人员：屈代鑫，张嘉杰，谢文平，张馨月，梁在华，黄小龙，庞嘉颖，麦倩婷，
申请(专利权)人：广东东阳光药业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44