一种高哌嗪的高效液相检测方法技术

本发明专利技术公开了一种高哌嗪的高效液相检测方法，包括以下步骤：将盐酸法舒地尔注射液用水稀释并加入高哌嗪；在干燥的衍生管中，加入硼酸盐缓冲液以及衍生试剂；然后用石蜡膜封口，加热之后将衍生管冷却，得衍生样品；将衍生样品采用液相色谱仪，采集色谱图测得高哌嗪含量。本发明专利技术以Waters公司开发的反相高效液相色谱柱前衍生方法‑AccQ·Tag法为基础，利用衍生化试剂将荧光基团加在高哌嗪的氨基上；经修饰后的高哌嗪衍生物具有了紫外吸收，再利用高效液相色谱法进行定性和定量分析。本发明专利技术方法精密度高、稳定性好、重现性好，本发明专利技术丰富了检测高哌嗪含量的方法，填补了高哌嗪含量液相检测只能使用离子色谱法的空白。

A HPLC method for the determination of piperazine

【技术实现步骤摘要】
一种高哌嗪的高效液相检测方法
本专利技术涉及液相色谱检测领域，具体涉及一种高哌嗪含量高效液相的检测方法。
技术介绍
盐酸法舒地尔，是一种肌球蛋白轻链磷酸化酶、RHO激酶抑制剂和新型细胞内钙离子抗结剂，该药能改善脑组织微循环，有效缓解脑血管痉挛，保护缺血脑组织，促进神经再生，是一种具有广泛药理作用的新型药物，高哌嗪是盐酸法舒地尔合成过程中的中间体。它在常规的反相色谱柱上保留较弱，同时没有紫外吸收，且成盐后也不适合用气相检测，故而不易在生产中控制，由于高哌嗪无紫外吸收，极性大，采用高效液相色谱法无法进行有效检测，已有文献报道采用液相色谱法、紫外分光光度法、离子色谱法测定盐酸法舒地尔中高哌嗪的含量，但现有的检测方法测定结构准确度低，操作繁琐。因此，提供一种快速、简单、经济、应用范围广的高哌嗪液相检测方法是本领域技术人鱼亟需解决的技术问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种快速、简单、高效的高哌嗪液相检测方法为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：高哌嗪的高效液相检测方法，包括以下步骤：(1)将盐酸法舒地尔注射液用水稀释成每1ml中含盐酸法舒地尔0.3～0.6mg的溶液；(2)将高哌嗪用水稀释成每1ml中含高哌嗪0.12～2.4μg的溶液；(3)在步骤(1)中制得的盐酸法舒地尔稀释液中加入高哌嗪制成每1ml中含盐酸法舒地尔0.3～0.6mg、高哌嗪0.6～6μg的溶液作为供试品溶液，备用；(4)精密量取供试品溶液10μl，置干燥的衍生管中，加入硼酸盐缓冲液70μl之后涡旋混合15s，再加入衍生试剂20μl，涡旋混合60s；然后将衍生管用石蜡膜封口，在55℃条件下加热10min之后将衍生管冷却至22-28℃，即得衍生样品；(5)将衍生样品转移至微量进样管中，精密量取衍生样品10μl，按预设的色谱条件待色谱柱平衡好后，注入液相色谱仪，采集色谱图。进一步，上述步骤(4)中硼酸盐缓冲液选自美国Waters公司提供的WatersAccQFluor试剂盒中的WatersAccQ·Fluor硼酸缓冲液。更进一步，上述步骤(4)中衍生试剂制备方法为：1)取出WatersAccQFluor试剂盒中的WatersAccQ·Fluor衍生剂粉末A和WatersAccQ·Fluor衍生剂稀释剂B；2)从B瓶中吸取稀释剂1ml至A瓶中，加盖密封，震荡10s钟，然后55℃下加热30min，使衍生剂粉末全部溶解，取出放冷后，即得衍生试剂，并于干燥器内存放。进一步，上述步骤(5)中色谱条件如下：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，色谱柱规格为：4.6×250mm，5μm；检测器为紫外检测器；检测波长为248nm；流动相为三水合醋酸钠水溶液-乙腈；流动相流速为0.9～1.1ml/min；进样体积为10μl；色谱柱柱温为27～33℃。更进一步，上述流动相中：乙腈的体积比例范围为22％～28％；三水合醋酸钠水溶液的体积比例范围为78％～72％；流动相中三水合醋酸钠水溶液浓度为0.02mol/L，pH值为4.8～5.2。与现有技术相比本专利技术的有益效果在于：本专利技术以Waters公司开发的反相高效液相色谱柱前衍生方法-AccQ·Tag法为基础，利用衍生化试剂将荧光基团加在高哌嗪的氨基上；经修饰后的高哌嗪衍生物具有了紫外吸收，再利用反相高效液相色谱法进行定性和定量分析。本专利技术中高哌嗪的液相检测方法精密度高、稳定性好、重现性好，本专利技术丰富了检测高哌嗪含量的方法，同时填补了高哌嗪含量液相检测只能使用离子色谱法的空白，也为盐酸法舒地尔及相关制剂质量控制方法提供了参考。附图说明图1为本专利技术实施例1的HPLC图；图2为本专利技术实施例2和实施例3的HPLC图；图3为本专利技术实施例4和实施例5的HPLC图；图4为本专利技术试验例1专属性试验色谱图；图5为本专利技术试验例2系统适用性试验色谱图；图6为本专利技术试验例3线性回归曲线图；图7为本专利技术试验例3线性与线性范围色谱图；图8为本专利技术试验例4检测限色谱图；图9为本专利技术试验例5定量限色谱图；图10为本专利技术试验例6重复性精密度试验色谱图；图11为本专利技术试验例7样品加样回收率试验准确度色谱图；图12为本专利技术试验例8.1流动相配比变化范围考察色谱图；图13为本专利技术试验例8.2流动相pH值变化范围考察色谱图；图14为本专利技术试验例8.3流动相流速变化范围考察色谱图；图15为本专利技术试验例8.4柱温变化考察色谱图；图16为本专利技术试验例8.5不同色谱柱的影响考察色谱图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。仪器：高效液相色谱仪Waterse2695，包括液相泵、紫外检测器、进样器等。试剂：三水合醋酸钠(优级纯)、乙腈(色谱纯)、磷酸(优级纯)色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱如图1所示，以下各实施例的基本试验条件相同。以下各实施例均照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定。实施例1色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.02mol/L三水合醋酸钠(pH＝5.0)-乙腈(75:25)为流动相采用梯度洗脱；检测波长为248nm，柱温30℃，进样量10μl。测定法：精密量取本品和高哌嗪对照品适量，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含盐酸法舒地尔0.6mg和高哌嗪0.6μg的溶液，作为供试品溶液；另取高哌嗪对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含高哌嗪1.2μg的溶液，作为对照品溶液。样品衍生：精密量取供试品溶液10μl，置于干燥的直径6mm，高50mm的衍生管中，加入缓冲液(Buffer1)70μl，涡旋混合15s，加入衍生试剂20μl，涡旋混合60s，衍生管用石蜡膜封口，于55℃加热10min，取出放冷至室温，转移至微量进样管中，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取高哌嗪对照品溶液10μl，同法操作，并测定。按外标法以峰面积计算，不得超过0.2％。实施例2色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.02mol/L三水合醋酸钠(pH＝5.0)-乙腈(78:22)为流动相，采用等度洗脱；检测波长为248nm，柱温30℃，进样量10μl。测定法：精密量取本品和高哌嗪对照品适量，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含盐酸法舒地尔0.6mg和高哌嗪0.6μg的溶液，作为供试品溶液；另取高哌嗪对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含高哌嗪1.2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高哌嗪的高效液相检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)将盐酸法舒地尔注射液用水稀释成每1ml中含盐酸法舒地尔0.3～0.6mg的溶液；/n(2)将高哌嗪用水稀释成每1ml中含高哌嗪0.12～2.4μg的溶液；/n(3)在步骤(1)中制得的盐酸法舒地尔稀释液中加入高哌嗪制成每1ml中含盐酸法舒地尔0.3～0.6mg、高哌嗪0.6～6μg的溶液作为供试品溶液，备用；/n(4)供试品溶液，置干燥的衍生管中，加入硼酸盐缓冲液之后涡旋混合，再加入衍生试剂，在进行涡旋混合；然后将衍生管用石蜡膜封口并加热，然后将衍生试管进行冷却，即得衍生样品；/n(5)将衍生样品转移至微量进样管中，精密量取衍生样品10μl，按预设的色谱条件待色谱柱平衡好后，注入液相色谱仪，采集色谱图。/n

【技术特征摘要】
1.一种高哌嗪的高效液相检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将盐酸法舒地尔注射液用水稀释成每1ml中含盐酸法舒地尔0.3～0.6mg的溶液；
(2)将高哌嗪用水稀释成每1ml中含高哌嗪0.12～2.4μg的溶液；
(3)在步骤(1)中制得的盐酸法舒地尔稀释液中加入高哌嗪制成每1ml中含盐酸法舒地尔0.3～0.6mg、高哌嗪0.6～6μg的溶液作为供试品溶液，备用；
(4)供试品溶液，置干燥的衍生管中，加入硼酸盐缓冲液之后涡旋混合，再加入衍生试剂，在进行涡旋混合；然后将衍生管用石蜡膜封口并加热，然后将衍生试管进行冷却，即得衍生样品；
(5)将衍生样品转移至微量进样管中，精密量取衍生样品10μl，按预设的色谱条件待色谱柱平衡好后，注入液相色谱仪，采集色谱图。


2.根据权利要求1所述一种高哌嗪的高效液相检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述的硼酸盐缓冲液选自美国Waters公司提供的WatersAccQFluor试剂盒中的WatersAccQ·Fluor硼酸缓冲液。


3.根据权利要求1所述一种高哌嗪的高效液相检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述衍生试剂制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨万运，王智军，肖海荣，孙国琳，潘潇，
申请(专利权)人：山东威高药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37