一种改善扩增特异性和均一性的多重PCR方法技术

本发明专利技术属于核酸检测技术领域，具体涉及一种改善扩增特异性和均一性的多重PCR方法。该方法包括：从样本中提取基因组DNA；将所提取到的基因组DNA进行片段化，并进行纯化；以经纯化的基因组DNA为模板，使用多个特异性引物对，进行PCR扩增反应，其中，在所述PCR扩增反应中，使用由低到高的差异化温度进行退火。本发明专利技术对DNA片段化并纯化处理，可以使模板与引物快速结合，提高引物使用率。先在较低的退火温度模式下，让扩增引物充分结合到模板DNA上，再逐步提高退火温度，提高各引物结合的特异性；这使得多重PCR的扩增特异性和均一性得到明显改善。

【技术实现步骤摘要】
一种改善扩增特异性和均一性的多重PCR方法
本专利技术属于核酸检测
，具体涉及一种改善扩增特异性和均一性的多重PCR方法。
技术介绍
多重PCR(multiplexPCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，是在普通PCR的基础上加以改进，于同一PCR反应体系里加上二对以上特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。由于多重PCR具有高效性、系统性及经济简便性等特点，被提出以后便得到迅速发展，现已成为生命科学等领域一项重要的应用技术。广泛用于多种病原微生物的同时检测或鉴定某些病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型鉴定等方面。多重PCR体系中含有多对扩增引物，需要同时对多个位点进行特异性扩增，这并非是单一PCR的简单混合，在实际操作中会受到多种因素的影响。比如多重PCR中的不同扩增片段会互相竞争资源，而且，引物对与引物对之间可能会发生错配等现象，从而降低多重PCR的扩增特异性和不同片段扩增的均一性。为了突破多重PCR的上述难点，很多研究从引物设计这一关键环节进行优化调整，获得了一些突破，但当扩增引物数增加到一定数量后，扩增特异性和均一性无法得到保证。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术从引物设计、模板DNA优化和扩增引物退火温度等方面进行研究，提供一种改善扩增特异性和均一性的多重PCR方法。因此，本专利技术的目的之一在于提供一种多重PCR方法。本专利技术所采用的技术方案如下文所述。一种多重PCR方法，包括以下步骤：从样本中提取基因组DNA；将所提取到的基因组DNA进行片段化，并进行纯化；以经纯化的基因组DNA为模板，使用多个特异性引物对，进行PCR扩增反应，其中，在所述PCR扩增反应中，使用由低到高的差异化退火温度进行退火。进一步地，所述差异化退火温度可以为从50℃，每次升高1～5℃，逐渐升高至70℃，优选每次升高2～5℃、3～5℃或3～4℃，最优选每次升高3℃。进一步地，所述PCR扩增反应中，退火时间可以为10～40s，优选为15～35s，更优选为20～30s。在本专利技术的一个实施方式中，所述PCR扩增反应的退火时间为30s。退火时间太短会导致引物结合不充分，退火时间太长会导致模板自连。进一步地，在所述多个特异性引物对中，各上游引物和下游引物的5’端均添加有通用接头序列，优选所述上游引物或所述下游引物还包括条形码序列。进一步地，通过超声打断，打断所述基因组DNA，使基因组DNA片段化，以得到150～550bp，优选150～450bp，更优选150～350bp的DNA片段。较长的模板DNA容易形成高级结构，使DNA聚合酶难以与模板结合，也就实现不了其聚合功能，且存在变性困难的问题，这都将影响PCR扩增的效率。模板DNA太短，将影响引物与模板的结合，从而影响多重PCR扩增的特异性。进一步地，通过磁珠或切胶回收的方式，对片段化的所述基因组DNA进行。进一步地，上述PCR扩增的程序为：(1)98℃预变性1min；(2)98℃变性10s，59℃退火30s，72℃延伸30s，6个循环；(3)98℃变性10s，62℃退火30s，72℃延伸30s，6个循环；(4)98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s，6个循环；(5)98℃变性10s，68℃退火30s，72℃延伸30s，6个循环；(6)98℃变性10s，70℃退火延伸1min，6个循环；(7)72℃延伸5min；进一步地，多个所述特异性引物对包括10个或更多的引物对。进一步地，多个所述特异性引物对包括50个或更多的引物对。进一步地，多个所述特异性引物对包括184个或更多的引物对。进一步地，所述特异性引物选自SEQIDNO:3～370。进一步地，各所述上游引物的5’端添加有如SEQIDNO:1所示的通用接头序列，各所述下游引物的5’端添加有如SEQIDNO:2所示的通用接头序列。在本专利技术的一个实施方式中，所述PCR扩增的反应体系可以使用本领域常用的多重PCR的酶或者酶预混液，例如可以为PhusionHFmustermix、AmpliTaq360MasterMix、KAPAHiFiHotStartReadyMix(2×)等。在本专利技术的一个实施方式中，所述PCR扩增的反应体系可以为：38μLPhusionHFmustermix、7μLPrimermix、15ng模板DNA和4μLDMSO。更进一步地，所述多重PCR方法还包括使用针对所述通用接头序列的引物，进行第二轮PCR扩增反应。优选地，在进行所述第二轮PCR扩增反应之前，对PCR产物进行纯化。进一步地，所述第二轮PCR扩增的程序为：(1)98℃预变性1min；(2)98℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸30s，3个循环；(3)98℃变性10s，72℃退火延伸1min，8个循环；(7)72℃延伸5min。进一步地，上述第二轮PCR扩增反应可以使用本领域常用的PCR酶或者酶预混液。所述第二轮PCR扩增的反应体系为：25μLPhusionHFmustermix、24μL第一轮多重PCR纯化产物、4μLDMSO、0.5μL25uM通用PCR外侧上游引物和0.5μL25uM通用PCR外侧下游引物。在本专利技术的一个实施方式中，在特异性引物对的上、下游引物上分别添加了适用于Illumina测序的接头序列。在本专利技术的一个实施方式中，在特异性引物对的上、下游引物上分别添加了19bp和34bp的适用于Illumina测序的接头序列。因此，前两个PCR循环中若退火温度太高，就会影响引物和模板的结合，从而降低引物的扩增效率和特异性。本专利技术还提供一种上述多重PCR方法在构建二代测序平台文库中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术将提取的基因组DNA进行片段化和纯化处理之后，再进行PCR扩增。在片段化处理过程中，由于是机械作用力，打断后的DNA片段大小是呈一个正态分布。除了大部分设定的目标大小片段外，还会存在部分小于目标大小的片段。这部分小于目标大小的片段通常包括几个或者几十个碱基，这些较小DNA片段会造成非特异性扩增，从而影响特异性。为了克服这一问题，本专利技术采用了磁珠或切胶回收的方式对打断后的模板进行纯化，从而消除这部分较小DNA片段的不利影响。通过筛选出特定长度的DNA作为模板进行扩增，可以使多重PCR的特异性引物与模板充分快速的结合，从而提高引物的使用率。另外，本专利技术根据扩增引物的退火温度，建立了一种从低到高的差异化退火循环的PCR扩增反应方法，即上述的TOCHUP差异化退火循环模式。本专利技术的多重PCR扩增反应，一方面可以先在较低的退火温度模式下，让扩增引物充分结合到模板DNA上，对模板DNA进行初步扩增，得到最大丰度的扩增产物，另一方面，通过差异化的退火温度，使不同的引物在相应最适合的退火温度下，充分结合到模板DNA上，使不同的引物对得到充分的利用，从而本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多重PCR的方法，其特征在于，所述方法包括：/n从样本中提取基因组DNA；/n将所提取的基因组DNA进行片段化，并进行纯化；/n以经纯化的基因组DNA为模板，使用多个特异性引物对，进行PCR扩增反应，其中，在所述PCR扩增反应中，使用由低到高的差异化退火温度进行退火。/n

【技术特征摘要】
1.一种多重PCR的方法，其特征在于，所述方法包括：
从样本中提取基因组DNA；
将所提取的基因组DNA进行片段化，并进行纯化；
以经纯化的基因组DNA为模板，使用多个特异性引物对，进行PCR扩增反应，其中，在所述PCR扩增反应中，使用由低到高的差异化退火温度进行退火。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述差异化退火温度为从50℃，每次升高1～5℃，逐渐升高至70℃，优选每次升高2～5℃、3～5℃或3～4℃，更优选每次升高3℃。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应中，退火时间为10～40s，优选为15～35s，更优选为20～30s。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述多个特异性引物对中，各上游引物和下游引物的5’端均添加有通用接头序列，优选所述上游引物或所述下游引物还包括条形码序列。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括使用针对所述通用接头序列的引物，进行第二轮PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱碧银，王益民，何鑫玺，王晓锋，卜中鑫，杜元平，
申请(专利权)人：人和未来生物科技长沙有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43