一种酶法制备5’-鸟苷酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种酶法制备5’‑鸟苷酸的方法，属于食品加工技术领域。所述制备方法包括：以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酸性磷酸转移酶突变体纯酶为催化剂，添加到含有鸟苷和焦磷酸钠的pH为3.6～9.0的反应溶液中，在25～60℃条件下进行催化反应，反应结束后，获得含5’‑鸟苷酸的混合液，再经分离纯化获得5’‑鸟苷酸。本发明专利技术选用的酸性磷酸转移酶突变体具有磷酸转移酶活性高，水解酶活性低，底物特异性高的优点；方法工艺环保，反应条件温和，成本低，得到的目标产物收率高，制备方法简单，适用于5’‑鸟苷酸的工业化生产，应用前景广阔。

An enzymatic method for the preparation of 5 '- guanosine

The invention discloses a method for preparing 5 '- guanosine acid by enzymatic method, which belongs to the technical field of food processing. The preparation method comprises the following steps: Taking the acid phosphotransferase mutant pure enzyme with amino acid sequence as shown in SEQ ID No.1 as the catalyst, adding it to the reaction solution with pH of 3.6-9.0 containing guanosine and sodium pyrophosphate, catalyzing the reaction at 25-60 \u2103, after the reaction, obtaining the mixed solution containing 5 \u2011 guanosine acid, and then obtaining 5 \u2011 guanosine acid through separation and purification. The acid phosphotransferase mutant selected by the invention has the advantages of high phosphotransferase activity, low hydrolase activity and high substrate specificity; the process is environmentally friendly, the reaction conditions are mild, the cost is low, the yield of the target product is high, the preparation method is simple, and it is suitable for the industrial production of 5 \u2011 guanosine acid, and the application prospect is broad.

【技术实现步骤摘要】
一种酶法制备5’-鸟苷酸的方法
本专利技术涉及食品加工
，具体涉及一种酶法制备5’-鸟苷酸的方法。
技术介绍
5’-鸟苷酸(Guanosine-5’-monophosphate即5’-GMP)是广泛应用于食品的核苷酸类调味料，在食品加工过程中，将其与谷氨酸钠搭配使用，构成食品基本的调味料，具有显著增鲜效果，因此也被称为呈味核苷酸。目前呈味核苷酸的生产方法主要有四种：化学合成法、微生物发酵法、酶解法、生物催化法。化学合成法主要是利用核苷为原料进行磷酸酯化反应。常用的磷酸化试剂主要是磷酸或焦磷酸的活性衍生物，如焦磷酸酰氯、双-对硝基苯焦磷酸、磷酸的一氯和二氯衍生物等，而工业上广泛采用的是三氯氧化磷。要在核苷的5’位羟基上导入磷酸基而得到5’-核苷酸，需在磷酸化反应前预先用保护基保护核苷上核糖的2’和3’位羟基，待磷酸化完成后脱去保护基。因采用了保护、去保护步骤使得此种方法的反应整体产率下降。化学合成法所用到的试剂即昂贵又有毒性，因此一般用于生产一些有特殊用途的5’-核苷酸及其衍生物，用于工业化生产有一定的难度。微生物发酵法分为一步法和二步法。一步法即直接发酵法：利用微生物发酵直接生产5’-肌苷酸和5’-黄苷酸。二步法指发酵法和化学法相结合的方法：先采用微生物发酵生产核苷，再经化学法使之磷酸化，最后得到5’-肌苷酸和5’-鸟苷酸。微生物发酵法副产物少，成本低，但其应用受到微生物特性的很大限制。酶解法已成为制备各种天然核苷酸的经典方法，此法历史最长、技术也最成熟，目前大部分的核苷酸是采用酶解法来生产的。酶解法制备核苷酸一次即可以得到4种核苷酸的混合物，酶的利用率较高，但是在后期要提取得到4种高纯度产品的难度很大，使得生产周期长，分离纯化工艺繁琐，产品纯度不高。生物催化法：生物催化核苷磷酸化法，主要是利用生物酶催化。目前，可用于催化5’-鸟苷酸合成的酶主要是激酶、酸性磷酸转移酶(AP/PTase)等。激酶是一类可将来自ATP的磷酸基转移到别的磷酸受体的磷酸转移酶，可用于合成多种5’-核苷酸，反应式为：ATP+核苷＝ADP+5’-核苷酸。此方法的不足之处是在催化过程中需要一直消耗ATP，所以必须同时培养可再生反应中消耗的ATP的微生物或者添加大量的价格较高的ATP来完成反应，成本较高，使得此法受到限制。以酸性磷酸转移酶催化鸟苷与磷酸基团供体合成5’-鸟苷酸，具有简单、高效、周期短、成本低、符合环保要求等特点，适合工业化生产，相对以上公开的制备5’-鸟苷酸的工艺展现了较大的发展潜力。目前，我国发酵法生产鸟苷技术成熟，已经实现工业化，以此为基础进一步开发生产5’-鸟苷酸的关键是如何实现酶催化鸟苷的特异性磷酸化。因此，急需一种操作简便、安全，成本低廉，产物纯度高且环境友好的生产工艺。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够特异性催化鸟苷磷酸化的酸性磷酸转移酶，用于酶法制备5’-鸟苷酸，并提供一种操作简单、安全、反应条件温和，生产成本低，收率和纯度高，适于工业化生产的生产工艺。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的酸性磷酸转移酶突变体在催化鸟苷制备5’-鸟苷酸中的应用。所述酸性磷酸转移酶突变体是对来源于Morganellamorganii的酸性磷酸转移酶(AP/PTase)进行改造后获得，具体改造方法为：以Genebank公布的酸性磷酸转移酶原始氨基酸序列(Genebank索取号P28581)，去除前20个氨基酸序列，并对其中的2个氨基酸位点进行定点突变(G72D、I151T)。本专利技术研究表明，经改造后的酸性磷酸转移酶突变体对催化鸟苷表现出较高的底物特异性，而且具有磷酸转移酶活性高，水解酶活性低的特点，能够有效转化鸟苷合成5’-鸟苷酸。其反应式如下：反应式中，AcidPhosphotransferase为酸性磷酸转移酶；AcidPhosphatase为酸性磷酸水解酶。所述的酸性磷酸转移酶突变体具有双向作用。本专利技术还提供了所述酸性磷酸转移酶突变体的编码基因，根据大肠杆菌密码子频率进行密码子优化，优化后的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供了一种酶法制备5’-鸟苷酸的方法，包括：以氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的酸性磷酸转移酶突变体纯酶为催化剂，添加到含有鸟苷和焦磷酸钠的pH为3.6～9.0的反应溶液中，在25～60℃条件下进行催化反应，反应结束后，获得含5’-鸟苷酸的混合液，再经分离纯化获得5’-鸟苷酸。作为优选，在反应体系中，鸟苷的浓度为1～20mg/mL，焦磷酸钠的浓度为150～300mg/mL，酸性磷酸转移酶突变体纯酶的浓度为20～120μg/mL。更为优选，在反应体系中，鸟苷的浓度为1mg/mL，焦磷酸钠的浓度为150mg/mL，酸性磷酸转移酶突变体纯酶的浓度为20μg/mL，此条件下鸟苷的摩尔转化率达到97％。作为优选，所述反应溶液中采用pH为3.6～5.8的乙酸钠缓冲液作为反应介质。更为优选，所述反应介质为pH为4.0的乙酸钠缓冲液。研究表明，所述酸性磷酸转移酶突变体催化5’-鸟苷酸合成速率最快的pH条件为4.0，此pH值为该酶最适反应pH。作为优选，催化反应的温度为25～40℃。更为优选，催化反应的温度为35℃。研究表明，所述酸性磷酸转移酶突变体催化5’-鸟苷酸合成速率最快的温度条件为35℃。作为优选，催化反应的时间为6～8h。研究表明，催化反应的初始阶段，随着反应时间的延长，反应产物5’-鸟苷酸的浓度近似呈线性增加，到达6～8h时，5’-鸟苷酸的浓度达到最高。作为优选，所述酸性磷酸转移酶突变体纯酶的制备方法，包括：以含酸性磷酸转移酶突变体编码基因的重组大肠杆菌经培养至OD600＝0.6～0.8，加入终浓度为1mM的IPTG，25℃诱导10～12h，收集菌体，再经超声破碎获得细胞裂解液，离心取上清液，进一步分离纯化获得所述酸性磷酸转移酶突变体纯酶。本专利技术的方法不仅适用于5’-鸟苷酸的制备，还可通用于5’-单磷酸核苷酸酯类化合物的制备。本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术通过采用新的酶法工艺制备5’-鸟苷酸，成功解决了现有工艺中存在的技术问题，选用的酸性磷酸转移酶突变体具有磷酸转移酶活性高，水解酶活性低，底物特异性高的优点；制备方法简单，大大简化了5’-鸟苷酸工业化生产步骤，成功解决了现有化学合成工艺中存在的原料毒性、工艺复杂等技术问题。(2)原料来源广泛，对设备要求低。(3)本专利技术的方法工艺环保，反应条件温和，成本低，得到的目标产物收率高，适用于5’-鸟苷酸的工业化生产，应用前景广阔。附图说明图1为酸性磷酸转移酶纯化电泳图，其中M为蛋白Marker，泳道1为全细胞，泳道2为细胞破碎后上清液，泳道3为细胞破碎后沉淀，泳道4为纯化后的蛋白。图2为pH值对酸性磷酸转移酶催化性能的影响。图3为温度对酸性磷酸转移酶催化性能的影响。图4为不同底物浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的酸性磷酸转移酶突变体在催化鸟苷制备5’-鸟苷酸中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的酸性磷酸转移酶突变体在催化鸟苷制备5’-鸟苷酸中的应用。


2.一种酶法制备5’-鸟苷酸的方法，其特征在于，包括：以氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的酸性磷酸转移酶突变体纯酶为催化剂，添加到含有鸟苷和焦磷酸钠的pH为3.6～9.0的反应溶液中，在25～60℃条件下进行催化反应，反应结束后，获得含5’-鸟苷酸的混合液，再经分离纯化获得5’-鸟苷酸。


3.如权利要求2所述的酶法制备5’-鸟苷酸的方法，其特征在于，在反应体系中，鸟苷的浓度为1～20mg/mL，焦磷酸钠的浓度为150～300mg/mL，酸性磷酸转移酶突变体纯酶的浓度为20～120μg/mL。


4.如权利要求2所述的酶法制备5’-鸟苷酸的方法，其特征在于，所述反应溶液中采用pH为3.6～5.8的乙酸钠缓冲液作为反应介质。

【专利技术属性】
技术研发人员：张玲，夏海洋，
申请(专利权)人：台州学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33