结合有免疫检查点阻断剂的T淋巴细胞及其在制备抗肿瘤药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种结合有免疫检查点阻断剂的T淋巴细胞，其通过将T淋巴细胞分离并体外扩增，并在体外与免疫检查点阻断剂和激动型抗体结合而制得。通过将免疫检查点阻断剂与T淋巴细胞结合，确保了免疫检查点阻断剂随着T淋巴细胞快速进入宿主的免疫系统，人为将免疫检查点阻断剂结合于T淋巴细胞的表面，可快速而有效的弥补T淋巴细胞在自然状态下分泌的免疫检查点阻断剂不足的缺陷。在将本发明专利技术的结合有免疫检查点阻断剂的T淋巴细胞回输至宿主后有效抑制了肿瘤细胞的生长，降低癌症复发及转移。利用本发明专利技术的T淋巴细胞进行抗肿瘤时，无需了解肿瘤相关抗原，与传统过继转移细胞疗法相比，过程简便易行。

T lymphocytes combined with immunocheckpoint blockers and their application in the preparation of antitumor drugs

The invention discloses a T-lymphocyte combined with an immune checkpoint blocker, which is prepared by separating and amplifying the T-lymphocyte in vitro, and combining with the immune checkpoint blocker and the activated antibody in vitro. By combining the immune checkpoint blocker with T-lymphocyte, the immune checkpoint blocker can enter the host's immune system rapidly with T-lymphocyte. The artificial combination of the immune checkpoint blocker on the surface of T-lymphocyte can quickly and effectively make up for the deficiency of the immune checkpoint blocker secreted by T-lymphocyte in the natural state. The T-lymphocyte combined with the immunocheckpoint blocker of the invention can effectively inhibit the growth of tumor cells and reduce the recurrence and metastasis of cancer after being transported back to the host. When the T-lymphocyte of the invention is used for anti-tumor, there is no need to know the tumor related antigen, and the process is simple and easy compared with the traditional adoptive transfer cell therapy.

【技术实现步骤摘要】
结合有免疫检查点阻断剂的T淋巴细胞及其在制备抗肿瘤药物中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种结合有免疫检查点阻断剂的T淋巴细胞及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
虽然目前人类的医学技术水平已取得较大进步和发展，但是恶性肿瘤仍是威胁人类健康的重大疾病之一。近年来，肿瘤免疫治疗已逐渐成为研究热点，并取得了较大的成果。过继细胞转移(adoptivecelltransfer,ACT)疗法是肿瘤免疫治疗的热点研究领域之一。过继细胞转移疗法是指通过采集宿主自身的免疫细胞，经体外培养扩增或是为了增强其靶向性而进一步修饰处理后，将其重新输回宿主体内以提高肿瘤细胞的免疫原性和对效应细胞杀伤的敏感性。肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltratinglymphocytes,TILs)是过继细胞转移疗法中的一种重要的治疗细胞，使用患者自体肿瘤浸润淋巴细胞的癌症免疫疗法已显示在难治性转移性黑素瘤中介导持久的完全反应。TILs是存在于肿瘤微环境的T淋巴细胞，能够识别肿瘤相关抗原，包括新生肿瘤抗原(neoantigen)，因此具有高度特异的抗肿瘤反应和低毒性。然而，使用TILs进行抗肿瘤治疗中的主要限制因素之一是复杂的TILs制造过程。该过程需要在高剂量白介素-2(IL-2)存在下，从消化的肿瘤碎片或单细胞悬浮液的多孔培养物；经过初始培养3-5周后，通过将TILs样品与自体肿瘤细胞共培养来测试不同孔中TILs的肿瘤反应性；然后才能选择具有肿瘤反应性的样品用于大规模二级多克隆扩增，过程非常繁琐。不仅如此，TILs疗法需要确保TILs具有显著的自体肿瘤反应性。因此，在扩增阶段之前尽可能富集肿瘤特异性T细胞亚群可以增强最终细胞产物的肿瘤反应性并简化TILs生产过程。所以一个重要的问题是如何在不知道特异性肿瘤抗原的情况下将分选出肿瘤反应性T细胞。许多研究发现肿瘤反应性T细胞表达几种活化相关分子，例如CD137，可以作为肿瘤细胞特异性识别的产物。类似地，在T细胞活化时诱导耗竭型检查点分子，其中PD-1最有代表性。PD-1是一类表达于T细胞表面的球状蛋白，对于免疫抑制起着重要的作用。PD-1通过与肿瘤细胞分泌的配体PD-L1结合，并去磷酸化TCR信号通路上的多个关键分子，从而发挥对肿瘤抑制过程的免疫应答的负性调节作用。最近有研究发现CD8+PD-1+T细胞可以从肿瘤浸润物中特异性分离，并且在这些分离的组织中大多数都具有抗肿瘤反应性。由于从黑色素瘤和其他实体瘤中分离出的绝大多数CD8+T细胞表达PD-1，因此PD-1可以作为一个反映TILs对肿瘤保持特异性的标志物。然而分离表达PD-1+的T细胞用于过继治疗的一个问题是这些细胞处于耗竭状态或功能受损，这是由于肿瘤微环境会诱导TILs高表达PD-1分子。虽然T细胞能够特异性的杀伤肿瘤细胞，然而肿瘤细胞也会逐渐抑制T淋巴细胞的活性，以实现自我保护，比如通过启动免疫检查点(immunecheckpoint)等诸多途径使免疫细胞失活，达到逃避免疫识别和免疫清除的目的。近年来，人们已发现了多个免疫检查点信号通路。至今已有多个阻断免疫检查点的抗体治疗被批准作为临床上进行肿瘤治疗的药物。免疫检查点阻断剂通过阻断肿瘤微环境中的免疫检查点信号通路，改变肿瘤微环境，恢复并增强T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的功能。免疫检查点阻断剂中的PD-1抗体能通过对PD-1/PD-L1通路的抑制而提高抗肿瘤效果，但是PD-1抗体在临床应用中的抗癌效果并不理想，且其带来的治疗副作用较大。
技术实现思路
基于上述背景的情况下，本专利技术的目的之一，在于提供一种结合有免疫检查点阻断剂的T淋巴细胞，所述免疫检查点阻断剂结合于T淋巴细胞的表面。通过将免疫检查点阻断剂与T淋巴细胞结合，确保了免疫检查点阻断剂随着T淋巴细胞快速进入宿主免疫系统，通过人为将免疫检查点阻断剂结合于T淋巴细胞的表面，可快速而有效的弥补T淋巴细胞在自然状态下分泌的免疫检查点阻断剂不足的缺陷，因而提高了T淋巴细胞的抗肿瘤性能。进一步的，所述T淋巴细胞为肿瘤浸润淋巴细胞。肿瘤浸润淋巴细胞是存在于肿瘤微环境的T淋巴细胞，能够识别肿瘤相关抗原，具有高度特异的肿瘤反应性和低毒性，此外，表达PD-1的肿瘤浸润淋巴细胞虽然表现出功能耗竭，但可以作为一个反映TILs对肿瘤保持特异性的标志物，因此无需了解肿瘤新生抗原即可确保本专利技术的T淋巴细胞具有较高的肿瘤反应性。更进一步的，所述免疫检查点阻断剂为PD-1抗体、LAG-3抗体、TIM-3抗体、TIGIT抗体、CTLA-4抗体和VISTA抗体中的至少一种。将肿瘤浸润T淋巴细胞分离并体外扩增，在体外与免疫检查点阻断剂反应结合后，增强了TILs的抗肿瘤功能，而且，免疫检查点阻断剂可与肿瘤浸润T淋巴细胞进行靶向结合，使得免疫检查点阻断剂充分结合于T淋巴细胞的表面，因而确保进入宿主免疫系统中的免疫检查点阻断剂有效的发挥抗肿瘤作用并最大可能的降低了进入生物体内的免疫检查点阻断剂的使用量，因而降低了其副作用。更进一步的，所述T淋巴细胞上还结合有激动型抗体，所述激动型抗体选自OX40抗体、4-1BB抗体、ICOS抗体和GITR抗体中的至少一种。更进一步的，所述肿瘤浸润淋巴细胞按照如下方法制备：(1)切下肿瘤组织块，去除脂肪等其他组织，置于含双抗的PBS缓冲液中浸泡5分钟；(2)将步骤(1)得到的肿瘤组织块通过全自动组织处理器处理后，收集细胞悬液并过滤后收集；(3)将步骤(2)得到的细胞悬液中加入红细胞裂解液，孵育后加入PBS终止裂解，离心处理，弃上清，以PBS洗涤细胞后，用PBS重悬；(4)将步骤(3)获得的肿瘤浸润淋巴细胞计数，用荧光标记CD3和PD-1的流式抗体染色，用PBS洗涤，离心处理弃上清，重悬于PBS中，进行CD3+PD-1+子集的分选；(5)向步骤(4)获得的肿瘤浸润淋巴细胞中加入经辐照的鼠PBMC、人白介素-2和可溶性CD3抗体，刺激淋巴细胞增殖。本专利技术的目的之二，在于提供本专利技术的目的之一的结合有免疫检查点阻断剂的T淋巴细胞的制备方法，其包括如下步骤：将所述免疫检查点阻断剂与所述肿瘤浸润淋巴细胞进行混匀、孵育和充分洗涤。利用本专利技术的制备方法可将免疫检查点阻断剂与T淋巴细胞进行充分结合，并将免疫检查点阻断剂充分附着于T淋巴细胞的表面，因而免疫检查点阻断剂能随着T淋巴细胞被一起转运。本专利技术的目的之三，在于提供一种将结合有免疫检查点阻断剂的T淋巴细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。利用本专利技术的结合有免疫检查点阻断剂的T淋巴细胞进行抗肿瘤治疗时无需了解肿瘤相关抗原，与传统过继转移细胞疗法相比，过程简便易行。进一步的，所述T淋巴细胞为肿瘤浸润淋巴细胞，所述肿瘤浸润淋巴细胞按照如下方法制备：(1)切下肿瘤组织块，去除脂肪等其他组织，置于含双抗的PBS缓冲液中浸泡5分钟；(2)将步骤(1)得到的肿瘤组织块通过全自动组织处理器处理后，收集细胞悬液并过滤后收集；(3)将步骤(2)得到的细胞悬液中加入红细胞裂本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种结合有免疫检查点阻断剂的T淋巴细胞，其特征在于，所述免疫检查点阻断剂结合于T淋巴细胞的表面。/n

【技术特征摘要】
1.一种结合有免疫检查点阻断剂的T淋巴细胞，其特征在于，所述免疫检查点阻断剂结合于T淋巴细胞的表面。


2.根据权利要求1所述的结合有免疫检查点阻断剂的T淋巴细胞，其特征在于，所述T淋巴细胞为肿瘤浸润淋巴细胞。


3.根据权利要求2所述的结合有免疫检查点阻断剂的T淋巴细胞，其特征在于，所述免疫检查点阻断剂为PD-1抗体、LAG-3抗体、TIM-3抗体、TIGIT抗体、CTLA-4抗体和VISTA抗体中的至少一种。


4.根据权利要求3所述的结合有免疫检查点阻断剂的T淋巴细胞，其特征在于，在所述T淋巴细胞上还结合有激动型抗体，所述激动型抗体选自OX40抗体、4-1BB抗体、ICOS抗体和GITR抗体中的至少一种。


5.根据权利要求2-4中任一项所述的结合有免疫检查点阻断剂的T淋巴细胞，其特征在于，所述肿瘤浸润淋巴细胞按照如下方法制备：
(1)切下肿瘤组织块，去除脂肪等其他组织，置于含双抗的PBS缓冲液中浸泡5分钟。
(2)将步骤(1)得到的肿瘤组织块通过全自动组织处理器处理后，收集细胞悬液并过滤后收集；
(3)将步骤(2)得到的细胞悬液中加入红细胞裂解液，孵育后加入PBS终止裂解，离心处理，弃上清，以PBS洗涤细胞后，用PBS重悬；
(4)将步骤(3)获得的肿瘤浸润淋巴细胞计数，用荧光标记CD3和PD-1的流式抗体染色，用PBS洗涤，离心处理弃上清，重悬于PBS中；进行CD3+PD-1+子集的分选；
(5)向步骤(4)获得的肿瘤浸润淋巴细胞中加入经辐照的鼠PBMC、人白介素-2和可溶性CD3抗体，刺激淋巴细胞增殖。


6.权利要求2或3所述的结合有免疫检查点阻断剂的T淋巴细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪超，储家成，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32