Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠、其制备方法及利用其提取外泌体的方法技术

本发明专利技术提供一种Annexin V‑FITC外泌体捕获亲和磁珠、其制备方法及提取方法，主要包括以下步骤：(1)表达和纯化Annexin V，制备Annexin V‑FITC，构建Annexin V‑FITC外泌体捕获亲和磁珠；(2)细胞培养上清液分离与浓缩：细胞培养后分离出细胞培养上清液，并经浓缩处理；(3)外泌体提取：将步骤(2)所得细胞培养上清液与外泌体捕获亲和磁珠共孵育，得到亲和磁珠‑外泌体复合物；(4)外泌体洗脱，将得到的亲和磁珠‑外泌体复合物与洗脱液共孵育，收集洗脱液，即为所提取分离的外泌体产物。本发明专利技术所述外泌体捕获亲和磁珠可重复使用，提取方便，且提取得到的外泌体纯度高。

Annexin V-FITC exosomes capture affinity magnetic beads, its preparation method and its extraction method

The invention provides an annexin V \u2011 FITC exosomes capture affinity magnetic bead, a preparation method and an extraction method thereof, which mainly includes the following steps: (1) expressing and purifying annexin V, preparing annexin V \u2011 FITC, constructing annexin V \u2011 FITC exosomes capture affinity magnetic bead; (2) cell culture supernatant separation and concentration: after cell culture, the cell culture supernatant is separated and treated by concentration; (3) Exosomes extraction: the supernatant of cell culture obtained in step (2) was incubated with the exosomes capture affinity magnetic beads to obtain the affinity magnetic beads \u2011 exosomes complex; (4) the exosomes were eluted, and the affinity magnetic beads \u2011 exosomes complex was incubated with the eluent to collect the eluent, which is the exosomes product extracted and separated. The exosome capture affinity magnetic bead of the invention can be reused, is easy to extract and has high purity.

【技术实现步骤摘要】
AnnexinV-FITC外泌体捕获亲和磁珠、其制备方法及利用其提取外泌体的方法
本专利技术属于外泌体提取
，具体涉及AnnexinV-FITC外泌体捕获亲和磁珠、其制备方法及利用其提取外泌体的方法。
技术介绍
外泌体(Exosomes)是通过细胞内多泡体与细胞膜融合产生的纳米级细胞外膜泡，其直径在30～150nm，密度为1.13～1.19g/mL，含有脂质、蛋白质、mRNA和miRNA等多种生物活性分子，广泛分布在血清、尿液、唾液和其他生物液体中。外泌体作为细胞间通信和遗传物质的重要转移载体，可通过传递其内容物给受体细胞，从而参与多种生理病理过程。目前细胞外泌体提取方法主要有超速离心法，蔗糖密度梯度离心法，超滤法，高聚物沉淀法以及免疫磁珠捕获法等，然而这些方法各有利弊。超速离心法是目前文献报道中使用最多且有效的提取的外泌体提取的方法，虽然该方法能够得到纯度较高的外泌体，但是其离心步骤繁琐，费时费力，且需要昂贵的设备。蔗糖密度梯度离心法，高聚物沉淀等方法虽然操作简便，耗时短，但是其纯度无法保障，往往含有大量杂蛋白，对细胞外本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.制备Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1-1：Annexin V原核表达：将已构建好的带有His标签的pET-28b-Annexin V质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，得到BL21(DE3)-pET-28b-Annexin V菌株，35-39℃且100-220rpm培养至OD值0.6-0.9，加入IPTG使体系中IPTG的终浓度为0.5-1mM，18-25℃过夜诱导表达；/n步骤1-2：蛋白提取：收集诱导表达后的菌体，加入PBS重悬菌体，冰浴条件下超声破碎0.5-2h，然后进行4℃，12000g离心20-60min，收集上...

【技术特征摘要】
1.制备AnnexinV-FITC外泌体捕获亲和磁珠的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1-1：AnnexinV原核表达：将已构建好的带有His标签的pET-28b-AnnexinV质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，得到BL21(DE3)-pET-28b-AnnexinV菌株，35-39℃且100-220rpm培养至OD值0.6-0.9，加入IPTG使体系中IPTG的终浓度为0.5-1mM，18-25℃过夜诱导表达；
步骤1-2：蛋白提取：收集诱导表达后的菌体，加入PBS重悬菌体，冰浴条件下超声破碎0.5-2h，然后进行4℃，12000g离心20-60min，收集上清液，并使用0.45μm水系滤膜进行抽滤，收集滤液备用；
步骤1-3：蛋白纯化：将步骤1-2收集的滤液与Ni-NTA亲和层析柱共孵育，再用不同浓度的咪唑缓冲液洗脱，收集并检测得到含有目的蛋白的洗脱液，使用10KDa超滤管进行浓缩，即得AnnexinV浓缩液；
步骤1-4：将AnnexinV浓缩液加入3.0-20.0kDa分子量截留的透析袋中，在50-120mM的NaHCO3溶液或50-120mM的Na2HPO3溶液中搅拌，2-15℃过夜透析，得到AnnexinV透析液；
步骤1-5：将步骤1-4得到的AnnexinV透析液稀释为0.5-5mg/mL，并将稀释后的AnnexinV透析液与0.5-5mg/mL的FITC溶液按照100-150：1的体积比混匀，2-15℃且30-100rpm旋转孵育2-10h得到混合液；
步骤1-6：将步骤1-5得到的混合液加入到3.0-20.0kDa分子量截留的透析袋中，并在PBS缓冲液中2-15℃过夜搅拌透析；
步骤1-7：收集步骤1-6透析后得到的AnnexinV-FITC溶液，使用MonoQ离子交换柱进行纯化得到AnnexinV-FITC复合物；
步骤1-8：亲和磁珠制备：将抗FITC抗体磁珠与步骤1-7得到的AnnexinV-FITC复合物混合，2-15℃且30-100rpm旋转孵育2-10h，即得到外泌体捕获亲和磁珠。


2.根据权利要求1所述的制备AnnexinV-FITC外泌体捕获亲和磁珠的方法，其特征在于，所述抗FITC抗体磁珠为超顺磁四氧化三铁磁珠。


3.采用权利要求1或2的方法制备得到的AnnexinV-FITC外泌体捕获亲和磁珠。


4.利用权利要求3所述AnnexinV-FITC外泌...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宏民，郑一超，范琦琦，赵丽娟，李迎迎，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南;41