治疗癌症的VEGFR-2 CAR免疫细胞制造技术

提供了使用CAR治疗人类癌症的组合物和方法。本发明专利技术包括工程化的CAR(嵌合受体抗原)和表达对VEGFR具有高亲和力的此类CAR的基因修饰的免疫细胞。更具体地，细胞是识别实体瘤上VEGFR‑2的CAR‑T细胞，其用途，其组合物及其制备方法。本发明专利技术包括靶向肿瘤血管生成的治疗VEGFR‑2依赖的癌症的治疗方法。嵌合抗原受体(CAR)，其与VEGFR‑2、VEGFR‑2的表位或片段、或VEGFR‑2的变体结合。

VEGFR-2 car immune cells for cancer treatment

A composition and method for treating human cancer using car are provided. The invention includes an engineered car (chimeric receptor antigen) and a genetically modified immune cell expressing such car with high affinity for VEGFR. More specifically, the cell is a car \u2011 T cell that recognizes VEGFR \u2011 2 on a solid tumor, its use, composition and preparation method. The invention includes a treatment method for VEGFR \u2011 2-dependent cancer targeting tumor angiogenesis. Chimeric antigen receptor (car), which binds to VEGFR \u2011 2, the epitope or fragment of VEGFR \u2011 2, or a variant of VEGFR \u2011 2.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】治疗癌症的VEGFR-2CAR免疫细胞专利
本专利技术涉及癌症免疫疗法，更具体地涉及用于治疗人类癌症的组合物和方法。本专利技术包括工程化的CAR(嵌合受体抗原)和表达对VEGFR具有高亲和力的此类CAR的基因修饰的免疫细胞。更具体地，细胞是识别实体瘤上VEGFR-2的CAR-T细胞，其用途、其组合物及其制备方法。本专利技术包括靶向肿瘤血管生成的治疗VEGFR-2依赖的癌症的治疗方法。专利技术背景免疫系统调节在恶性肿瘤治疗方面显示出巨大的希望。除了再活化肿瘤微环境中存在的T细胞的检查点抑制剂之外，外源性转导的嵌合抗原受体(CAR)-T细胞在白血病治疗的临床试验中提供了充满希望的响应。血管生成是新的血管形成的过程并且对肿瘤生长超出一定尺寸是必需的。血管生成促进了实体肿瘤的生长和转移。肿瘤分泌促血管生成因子血管内皮生长因子(VEGF)，其通过与血管内皮生长因子受体(VEGFR)结合作用于局部的内皮细胞。血管内皮生长因子，VEGF，是内皮细胞特异性有丝分裂原。因为通过特异性促进内皮细胞的增殖而起到血管生成诱导剂的作用，它在生长因子中是独特的。通过其高亲和力受体来介导VEGF的生物应答，所述受体在胚胎形成期间和肿瘤形成期间选择性地表达在内皮细胞上。血管内皮生长因子通过与许多受体结合来调节血管发育、血管生成和淋巴管生成。对于造血干细胞的募集以及单核细胞和巨噬细胞的迁移，VEGFR-1是必需的。VEGFR-2调节血管内皮功能并且VEGFR-3调节淋巴内皮细胞功能。亟需以肿瘤血管生成为目标的治疗或预防癌症的组合物和方法。该等需求包括使用具有临床活性的CAR治疗实体瘤，所述CAR识别在肿瘤细胞上表达的VEGFR-2从而帮助控制肿瘤相关的血管生成，从而试图限制/减少癌症进展/生长。专利技术概述多种肿瘤表达VEGFR-2。本文描述了靶向表达VEGFR-2的肿瘤的CAR和CAR-T细胞。本文所提供的抗VEGFR-2的CAR和CAR-T细胞具有抑制/减少血管生成和诱导肿瘤蜕变的用途。本专利技术提供了工程化以靶向实体瘤的CAR。一方面，基因工程化T细胞以产生允许T细胞识别肿瘤细胞上特异蛋白(抗原)的表达CAR的蛋白。然后在用于治疗前在实验室中使这些工程化的CAR-T细胞生长。其他方面，本文所述的CAR对VEGFR-2依赖的癌症具有高亲和力。本文所述的CAR的独特特异性来自使用sdAbs(单域抗体)代替工程化的CAR的scFv。由于其尺寸小，这提供了更高的亲和力。此类抗体还具有易于重折叠的自然倾向和生物物理稳定性。此外，它们可以识别常规抗体不可接近的表位并且能够被工程化。本专利技术的某些方面是包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列的人T细胞，其中所述CAR包含VEGFR-2结合结构域，其中所述CAR还包含跨膜结构域、4-1BB共刺激信号区以及CD3ζ信号结构域，其中所述T细胞源于患有癌症的人。在某些方面，治疗表达VEGFR-2的癌症。在本文所述的某些方面，用于CAR和CAR-T细胞中的sdAbs是VEGFR-2特异性的骆驼科单域抗体。在某些方面，sdAbs是VEGFR-2以及其片段或其变体特异性的。本专利技术的CAR构建体可以包含分离的或纯化的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含SEQIDNO:2-30中的一种序列，或与其具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％同一性的序列，或与其基本上同一的序列，所述抗体或其片段有或没有接头序列。在某些方面，接头序列可以包含在某些方面对化学结合有用的末端半胱氨酸。适合于本专利技术的单域抗体的接头序列可选自SEQIDNO:54-65。在某些方面，接头序列可以还包含C末端半胱氨酸，例如SEQIDNO:66-69。本文可使用与这些接头序列相似的序列。在某些方面，提供了表达本文所述的CAR的免疫细胞。免疫细胞通常是T细胞或CIK细胞，但也可以是自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和调节性T细胞。本文所述的某些方面，提供了用于制备VEGFR-2特异性的CAR-T的方法。在某些方面，所述方法可以是病毒性的或非病毒性的。更具体地，在某些方面中的方法是包含转座子的非病毒性方法。本专利技术提供了编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、一种或多种共刺激信号区以及CD3ζ信号结构域，所述抗原结合结构域是与VEGFR-2及其变体、片段和特定表位结合的sdAb。一方面，编码CAR的核酸序列包含SEQIDNO:79的核酸序列。在这一非限制性实例中，CAR包含AB1(SEQIDNO:2)。一方面，CAR中的抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段。通常，抗原结合片段是单域抗体或其片段。一方面，CAR中的sdAb与表达VEGFR-2的实体瘤结合。一方面，CAR中的共刺激信号区包含选自以下的共刺激分子的细胞内结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、及其任何组合。本专利技术还提供了分离的CAR，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号区和CD3ζ信号结构域。本专利技术还提供了包含编码CAR的核酸序列的细胞，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号区和CD3ζ信号结构域。一方面，包含CAR的免疫细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、CIK细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和调节性T细胞。本专利技术还提供了包含编码CAR的核酸序列的载体，其中所述CAR包含抗原结合结构域、共刺激信号区和CD3ζ信号结构域。本专利技术还提供了用于减少哺乳动物中肿瘤生长的方法。一方面，该方法包括向哺乳动物给予有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，其中所述CAR包含抗原结合结构域、共刺激信号区和CD3ζ信号结构域，其中所述抗原结合结构域是特异性识别VEGFR-2的sdAb。本专利技术还提供了用于减少哺乳动物中与肿瘤相关的血管生成的方法。一方面，该方法包括向哺乳动物给予有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，其中所述CAR包含抗原结合结构域、共刺激信号区和CD3ζ信号结构域，其中所述抗原结合结构域是特异性识别VEGFR-2的sdAb。本专利技术还包括治疗患有与VEGFR-2表达升高相关的肿瘤的哺乳动物的方法。一方面，该方法包括向哺乳动物给予有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，从而治疗哺乳动物，其中所述CAR包含VEGFR-2特异性的sdAb、共刺激信号区和CD3ζ信号结构域。一方面，细胞是自体T细胞。另一方面，细胞是同种异体T细胞。本专利技术还包括在被诊断患有癌症的人中产生持续存在的基因工程化的T细胞群的方法。一方面，该方法包括向人给予基因工程化以表达CAR的T细胞，其中所述CAR包含VEGFR-2特异性的抗原结合结构域、共刺本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.嵌合抗原受体(CAR)，其与VEGFR-2、VEGFR-2的表位或片段、或VEGFR-2的变体结合。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170105 US 62/442,649;20170403 US 62/480,712;20171.嵌合抗原受体(CAR)，其与VEGFR-2、VEGFR-2的表位或片段、或VEGFR-2的变体结合。


2.如权利要求1所述的CAR，其中所述CAR包含用于与VEGFR-2结合的单域抗体或其片段。


3.如权利要求2所述的CAR，其中所述单域抗体或其片段属于骆驼科(Camelidae)种。


4.如权利要求1至3中任一权利要求所述的CAR，其中所述CAR与VEGFR-2的表位结合。


5.如权利要求4所述的CAR，其中所述CAR与SEQIDNO:1中发现的表位结合。


6.如权利要求1至5中任一权利要求所述的CAR，其中所述CAR包含互补决定区(CDR)1；CDR2和/或CDR3，其中CDR1、CDR和CDR3中至少之一与VEGFR-2结合。


7.如权利要求1至6中任一权利要求所述的CAR，其中所述CAR包含至少一个具有选自SYAMG、AISWSDDSTYYANSVKG、HKSLQRPDEYTY的序列的CDR和与结合VEGFR-2的序列至少70％同一性的序列。


8.如权利要求1至7中任一权利要求所述的CAR，其包含SEQIDNO:78的序列或与SEQIDNO:78至少90％同一性的序列。


9.如权利要求1至8中任一权利要求所述的CAR，其包含间隔分子、跨膜区和一种或多种细胞信号结构域，所述细胞信号结构域选自人CD8-α蛋白、人CD28蛋白、人CD3-ζ蛋白、人FcRy蛋白、CD27蛋白、OX40蛋白、人4-IBB蛋白、前述任一种的修饰形式以及前述的任何组合。


10.如权利要求1至9中任一权利要求所述的CAR，其包含选自SEQIDNO:2-30或其片段或变体的序列。


11.如权利要求1至9中任一权利要求所述的CAR，其包含选自SEQIDNO:2-30或与SEQIDNO:2-30至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％同一性的序列，或与SEQIDNO:2-30基本同一的序列。


12.如权利要求10或11所述的CAR，其中所述序列包含选自SEQIDNO:54-69的接头序列。


13.如权利要求12所述的CAR，其中所述接头序列可以还包含C末端半胱氨酸。


14.如权利要求13所述的CAR，其中所述接头序列包含GSEQKGGGEEDDGC或其变体。


15.免疫细胞，其包含权利要求1至14中任一权利要求所述的CAR。


16.如权利要求15所述的免疫细胞，其中所述细胞是T细胞或细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞。


17.如权利要求15或16所述的免疫细胞，其还包含至少第二CAR。


18.如权利要求15至17中任一权利要求所述的免疫细胞，其还包含任选地极度活跃的转座子/转座酶系统。


19.如权利要求18所述的免疫细胞，其中所述转座子/转座酶系统是睡美人转座子/转座酶系统。


20.如权利要求18或19所述的免疫细胞，其中所述转座子/转座酶系统是SB100X转座子/转座酶系统。


21.如权利要求15至20中任一权利要求所述的免疫细胞，其还包含自杀基因。


22.如权利要求15至21中任一权利要求所述的免疫细胞，其被配制成包含药物载体、稀释剂和/或赋形剂的组合物。


23.编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中所述CAR包含VEGFR-2结合部分和免疫细胞激活部分，其中所述VEGFR-2结合部分与VEGFR-2或其变体或片段结合。


24.如权利要求23所述的核酸分子，其中所述VEGFR-2结合部分包含针对VEGFR-2或VEGFR-2的变体或片段的单克隆抗体或其抗原结合部分。


25.如权利要求24所述的核酸分子，其中所述VEGFR-2结合部分包含所述单克隆抗体的可变区。


26.如权利要求23至25中任一权利要求所述的核酸分子，其中所述免疫细胞激活部分包含任一种或多种以下蛋白中的T细胞信号结构域：人CD8-α蛋白、人CD28蛋白、人CD3-ζ蛋白、人FcRy蛋白、CD27蛋白、OX40蛋白、人4-IBB蛋白及其变体或片段。


27.如权利要求23至26中任一权利要求所...

【专利技术属性】
技术研发人员：巢立文，黄华友，田保民，玛尼·黛安·乌格，
申请(专利权)人：赫利克斯生物药品公司，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA