使用3D微流体细胞培养装置评价肿瘤细胞球体的方法制造方法及图纸

本文提供了在三维微流体装置中通过测定在不同条件下培养的等分试样中活细胞和死细胞相对水平的变化来评价肿瘤细胞球体的方法。本文所描述的方法允许离体再现肿瘤微环境，由此可以预测测试化合物在治疗肿瘤组织方面的体内有效性。

Evaluation of tumor cell spheroid using 3D microfluidic cell culture device

This paper provides a method to evaluate tumor cell spheres by measuring the relative changes of living cells and dead cells in aliquots cultured under different conditions in a three-dimensional microfluidic device. The method described in this paper allows tumor microenvironment to be reproduced in vitro, thereby predicting the in vivo efficacy of the test compound in the treatment of tumor tissue.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用3D微流体细胞培养装置评价肿瘤细胞球体的方法相关申请本申请要求2017年3月31日提交的美国临时申请第62/480,192号的权益，其全部内容以引用的方式并入本文中。联邦政府资助的研究本专利技术是依据美国国家卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的K08CA138918-01A1和R01CA190394-01在政府支持下提出。美国政府在本专利技术中享有一定权利。
技术介绍
现有的患者源性癌症模型，包括循环肿瘤细胞(CTC)、类器官培养物和患者源性异种移植物(PDX)可以指导精准癌症疗法，但要花费数周乃至数月来产生并缺失天然肿瘤免疫微环境。当前用于研究患者抗肿瘤免疫反应的方法还受到远程测量全血或血浆、或静态评估活检体限制。近来，已开发出用于短期培养鼠类和患者源性器官型肿瘤球体的3D微流体装置。一些研究人员认为，所培养的肿瘤球体比较接近地类似天然免疫微环境。希望的是，能够评估单一药物和药物组合对肿瘤微环境中肿瘤细胞的影响。如果有一种方式能同时离体评价免疫阻断与抗癌化合物的组合的作用，这将是特别有帮助的。迄今为止，评价肿瘤细胞的工作由于以下原因而变得繁杂：(i)肿瘤细胞当从身体取出时会发生变化；(ii)当从身体取出肿瘤细胞时不存在与肿瘤微环境连通的完整免疫系统；(iii)无法将肿瘤移出和培养的影响与在体外施加药物的影响相区分；及(iv)在分子水平上测量基于免疫的标记物和其它标记物的复杂性，这些标记物可基于在体外进行的实验预测药物是否能在体内起作用。到目前为止，尚无以一种高通量方式评价药物对在天然肿瘤微环境中的人类癌细胞的影响的简单分析法。
技术实现思路
意外地发现，培养的肿瘤球体的肿瘤微环境含有足以预测药物在体内投与时的活性的免疫组分。意外地发现，培养的肿瘤球体的肿瘤微环境含有足够的免疫组分，使得能够评估免疫阻断化合物与抗癌药物的组合，由此预测在体内投与所述药物的情况。意外地发现，可以通过光学方式可再现地评价培养的肿瘤球体的肿瘤微环境，以确定药物对所述球体内肿瘤细胞的影响，同时区分由培养肿瘤细胞的操作引起的对肿瘤细胞的影响。意外地发现，这些用于评价肿瘤球体的技术可以被用于测定在模拟体内出现的环境中活细胞和死细胞的相对量的高通量方法中。在一个方面，本专利技术涉及一种使用在3维微流体系统中培养的鼠类和患者源性器官型肿瘤球体(MDOTS/PDOTS)评价针对免疫检查点阻断(ImmuneCheckpointBlockade，ICB)的离体反应的新颖方法。从新鲜小鼠和人类肿瘤样品分离的球体保留自体淋巴和骨髓细胞群，包括抗原刺激过的浸润CD4和CD8T淋巴细胞的肿瘤，并对短期离体培养物中的ICB起反应。使用来源于抗PD-1敏感性MC38同基因小鼠癌症模型的MDOTS离体再现肿瘤杀灭，而在CT26和B16F10同基因模型中保持对于抗PD-1疗法的相对较高抗性。在来自患有黑素瘤和其它肿瘤的患者的PDOTS中PD-1阻断之后进行系统性细胞因子/趋化因子图谱分析(profiling)鉴别出免疫引诱剂CCL19和CXCL13的显著诱导作用，这在体内得到证实并且与肿瘤内免疫细胞浸润迹象相关。另外，还通过共诱导免疫抑制性趋化因子跟踪MDOTS和PDOTS中针对抗PD1治疗的抗性。离体图谱分析揭示，组合疗法可作为新颖治疗策略以增大在此情形中对PD-1阻断的敏感性，由此有效地预测体内肿瘤反应。这些发现展示了对PD-1阻断进行离体图谱分析的可行性，并提供一种有助于精准免疫肿瘤学并开发新颖治疗组合的新颖功能性方法。根据本专利技术的一个方面，提供一种用于在三维微流体装置中评价肿瘤细胞球体的方法。所述方法包含：自酶处理的肿瘤样品获得肿瘤球体，使所述肿瘤球体的第一等分试样悬浮于生物相容性凝胶中；使所述肿瘤球体的第二等分试样悬浮于生物相容性凝胶中；将在生物相容性凝胶中的所述肿瘤球体的所述第一等分试样放入第一个三维装置中，使所述第一等分试样与对死细胞具有选择性的第一荧光团染料接触，所述第一荧光团染料在结合至死细胞时发射第一波长的荧光，使所述第一等分试样与对活细胞具有选择性的第二荧光团染料接触，所述第二荧光团染料当结合至活细胞时发射不同于所述第一波长的第二波长的荧光，测量由所述第一等分试样中的所述第一荧光团染料和所述第二荧光团染料各自发射的总荧光，在第二个三维装置中培养所述第二等分试样，使所述第二等分试样与所述第一荧光团染料接触，使所述第二等分试样与所述第二荧光团染料接触，其中所述第二等分试样与所述第一荧光团染料和所述第二荧光团染料的接触是在所述第一等分试样与所述第一荧光团染料和所述第二荧光团染料接触之后至少24小时进行，测量由所述第二等分试样中的所述第一荧光团染料和所述第二荧光团染料各自发射的总荧光，其中所述等分试样中的每一种中活细胞与死细胞的比率增加或减少可得到评估。在一个实施例中，使用摄像机，优选地在至少2×、至少3×、至少4×或更高分辨率下，从每一个三维装置的正上方或正下方测量由第一荧光团染料和第二荧光团染料各自发射的总荧光，并且优选地其中将所述三维装置放在可移动的平台上，由此允许摄像机捕捉每一等分试样中的总荧光。在一些实施例中，死细胞荧光和活细胞荧光可以加在一起，得到活细胞和死细胞总量。死细胞的量可以用死细胞荧光占总荧光的百分比表示。活细胞的量可以用活细胞荧光占总荧光的百分比表示。在一些实施例中，死细胞荧光和活细胞荧光可以用比率，即，死细胞/活细胞或活细胞/死细胞表示。以这种方式，可以随时间跟踪死细胞比活细胞数量的变化，其中初始比率是在培养之前确定并且所述比率的改变是随时间测定。在一些实施例中，存在多份肿瘤球体等分试样，例如三份、或四份、或五份、或六份或超过六份等分试样，并且分别在第一等分试样与第一荧光团染料和第二荧光团染料接触之后例如两天、三天、四天、五天及超过五天，使第三份、第四份、第五份、第六份或超过第六份此类等分试样与第一荧光团染料和第二荧光团染料接触。测试等分试样的时间安排可以间隔任何时间段，如一天、不到一天、两天或三天或更多天。在一个实施例中，在将球体放入凝胶中之后六天，测试等分试样。在任一实施例中，在所述第二等分试样培养期间，使所述第二(或任何随后的)等分试样与至少一种测试化合物接触，并且其中所述第二等分试样的所述培养在所述测试化合物存在下进行至少24小时、至少两天、至少三天、至少四天、至少五天、或至少6天或更长时间。在任一前述实施例中，在所述第二等分试样培养期间，可使所述第二等分试样与至少两种测试化合物接触，并且其中所述第二等分试样的所述培养在所述测试化合物存在下进行至少24小时、至少两天、至少三天、至少四天、至少五天或至少6天，并且优选地其中所述测试化合物中的至少一种是免疫检查点抑制剂。球体的数量可以是研究人员易于得到的球体的任何数量，但在以下描述的系统中，所述第一等分试样和所述第二等分试样中球体的数量各自含有在约15个与30个之间的球体，优选地在约20个与本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于在三维微流体装置中评价肿瘤细胞球体的方法，所述方法包含：/n自酶处理的肿瘤样品获得肿瘤球体，/n使所述肿瘤球体的第一等分试样悬浮于生物相容性凝胶中；/n使所述肿瘤球体的第二等分试样悬浮于生物相容性凝胶中；/n将在生物相容性凝胶中的所述肿瘤球体的所述第一等分试样放入第一个三维装置中，/n使所述第一等分试样与对死细胞具有选择性的第一荧光团染料接触，所述第一荧光团染料在结合至死细胞时发射第一波长的荧光，/n使所述第一等分试样与对活细胞具有选择性的第二荧光团染料接触，所述第二荧光团染料在结合至活细胞时发射不同于所述第一波长的第二波长的荧光，/n测量由所述第一等分试样中的所述第一荧光团染料和所述第二荧光团染料各自发射的总荧光，/n在第二个三维装置中培养所述第二等分试样，/n使所述第二等分试样与所述第一荧光团染料接触，/n使所述第二等分试样与所述第二荧光团染料接触，其中所述第二等分试样与所述第一荧光团染料和所述第二荧光团染料的接触是在所述第一等分试样与所述第一荧光团染料和所述第二荧光团染料接触之后至少24小时进行，/n测量由所述第二等分试样中的所述第一荧光团染料和所述第二荧光团染料各自发射的总荧光，/n其中所述等分试样中的每一种中活细胞与死细胞的比率增加或减少能够被评估。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170331 US 62/480,1921.一种用于在三维微流体装置中评价肿瘤细胞球体的方法，所述方法包含：
自酶处理的肿瘤样品获得肿瘤球体，
使所述肿瘤球体的第一等分试样悬浮于生物相容性凝胶中；
使所述肿瘤球体的第二等分试样悬浮于生物相容性凝胶中；
将在生物相容性凝胶中的所述肿瘤球体的所述第一等分试样放入第一个三维装置中，
使所述第一等分试样与对死细胞具有选择性的第一荧光团染料接触，所述第一荧光团染料在结合至死细胞时发射第一波长的荧光，
使所述第一等分试样与对活细胞具有选择性的第二荧光团染料接触，所述第二荧光团染料在结合至活细胞时发射不同于所述第一波长的第二波长的荧光，
测量由所述第一等分试样中的所述第一荧光团染料和所述第二荧光团染料各自发射的总荧光，
在第二个三维装置中培养所述第二等分试样，
使所述第二等分试样与所述第一荧光团染料接触，
使所述第二等分试样与所述第二荧光团染料接触，其中所述第二等分试样与所述第一荧光团染料和所述第二荧光团染料的接触是在所述第一等分试样与所述第一荧光团染料和所述第二荧光团染料接触之后至少24小时进行，
测量由所述第二等分试样中的所述第一荧光团染料和所述第二荧光团染料各自发射的总荧光，
其中所述等分试样中的每一种中活细胞与死细胞的比率增加或减少能够被评估。


2.根据权利要求1所述的方法，其中使用摄像机，优选地在至少2×、至少3×、至少4×或更高分辨率下，从每一个三维装置的正上方或正下方测量由所述第一荧光团染料和所述第二荧光团染料各自发射的总荧光，并且优选地其中所述三维装置被放在能移动的平台上，由此允许所述摄像机捕捉每一等分试样中的总荧光。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述第二等分试样培养期间，使所述第二等分试样与至少一种测试化合物接触，并且其中所述第二等分试样的所述培养在所述测试化合物存在下进行至少24小时、至少两天、至少三天、至少四天、至少五天或至少6天。


4.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述第二等分试样培养期间，使所述第二等分试样与至少两种测试化合物接触，并且其中所述第二等分试样的所述培养在所述测试化合物存在下进行至少24小时、至少两天、至少三天、至少四天、至少五天或至少6天，并且优选地其中所述测试化合物中的至少一种是免疫检查点抑制剂。


5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其中所述第一等分试样和所述第二等分试样各自含有在约15个与30个之间的球体、优选地在约20个与25个之间的球体。


6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的方法，其中所述第一个三维装置是第一个三维微流体装置并且所述第二个三维装置是第二个三维微流体装置，并且任选地，在所述第一个三维微流体装置中培养所述第一等分试样，所述培养在使所述第一等分试样与所述第一荧光团染料和所述第二荧光团染料接触之前进行不到6小时、不到3小时、不到2小时且甚至不到1小时。


7.根据权利要求6所述的方法，其中在所述第一等分试样与所述第一荧光团染料和所述第二荧光团染料接触之前，未在所述第一个三维微流体装置中培养所述第一等分试样。


8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的方法，其中所述酶是胶原蛋白酶。


9.根据权利要求1至8中任一权利要求所述的方法，其中所述第一荧光团染料是碘化丙锭、DRAQ7、7-AAD、电子生物科学可固定细胞活力染料455UV、电子生物科学可固定细胞活力染料450、电子生物科学可固定细胞活力染料506、电子生物科学可固定细胞活力染料520、电子生物科学可固定细胞活力染料660、电子生物科学可固定细...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·W·詹金斯，D·巴比，C·P·帕韦莱茨，E·伊万诺娃，A·阿里夫，
申请(专利权)人：达纳法伯癌症研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US