乳白蛋白-油酸复合物在制备抑制肿瘤细胞能量代谢的药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了乳白蛋白‑油酸复合物在制备抑制肿瘤细胞能量代谢的药物中的应用。本发明专利技术发现α‑LA‑OA能够抑制肿瘤细胞的糖酵解过程，降低线粒体有氧呼吸过程对氧气的消耗量及ATP的产生量；另外还发现，α‑LA‑OA能够减弱HepG2细胞葡萄糖代谢途径中ATP的产生，从而达到抑制肿瘤细胞能量代谢的作用；利用HepG2肿瘤细胞模型证实，α‑LA‑OA能显著促进mTORC2靶蛋白Rictor、mSin1及Ser473‑Akt的表达，糖酵解途径中的多种酶的表达量显著降低。α‑LA‑OA能够激活mTORC2信号通路，抑制葡萄糖代谢途径中关键酶的活性，从而降低ATP的产生抑制肿瘤细胞的能量代谢。

The application of lactalbumin oleic acid complex in the preparation of drugs to inhibit energy metabolism of tumor cells

The invention discloses the application of lactalbumin oleic acid complex in the preparation of drugs for inhibiting energy metabolism of tumor cells. In the invention, it is found that \u03b1 - La \u2011 OA can inhibit the glycolysis process of tumor cells, reduce the consumption of oxygen and the production of ATP in the process of mitochondrial aerobic respiration; in addition, it is also found that \u03b1 - La \u2011 OA can reduce the production of ATP in the glucose metabolism pathway of HepG2 cells, so as to achieve the effect of inhibiting the energy metabolism of tumor cells; it is confirmed by HepG2 tumor cell model that \u03b1 - La \u2011 OA can significantly inhibit the energy metabolism of tumor cells In order to promote the expression of ritor, msin1 and ser473 \u2011 Akt, the expression of many enzymes in glycolysis pathway was significantly reduced. \u03b1 \u2011 La \u2011 OA can activate mtorc2 signaling pathway, inhibit the activity of key enzymes in glucose metabolism pathway, thus reduce the production of ATP and inhibit the energy metabolism of tumor cells.

【技术实现步骤摘要】
乳白蛋白-油酸复合物在制备抑制肿瘤细胞能量代谢的药物中的应用
本专利技术属于生物
，特别涉及乳白蛋白-油酸复合物(α-LA-OA)在制备抑制肿瘤细胞能量代谢的药物中的应用。
技术介绍
癌症是世界范围内的主要公共卫生问题。近年来虽然有关癌症的预防、治疗研究进展迅猛，但其发病率亦居高不下，据报道，2006～2016年期间，全球癌症的发病率增加了28％。因此，开发新型、有效的抗肿瘤药物仍是目前的研究热点，针对肿瘤细胞的分子靶向药物更是得到了广泛关注。α-乳白蛋白-油酸复合物(α-LA-OA)具有良好的抗肿瘤效果，其选择性杀死肿瘤细胞而不影响健康的分化细胞的活性不仅在人胶质母细胞瘤和膀胱癌的小鼠模型中得到验证，还在人皮肤乳头状瘤和膀胱癌患者身上得到了证实。但现有研究并未曾评估α-LA-OA处理肿瘤细胞后，肿瘤细胞能量代谢的变化，以及α-LA-OA处理肿瘤细胞后引起细胞能量代谢变化的机制。
技术实现思路
本专利技术的目的是以裸鼠异种移植瘤及人肝癌细胞(HepG2)为模型，研究α-LA-OA对肿瘤细胞能量代谢的影响及其作用机制，为解析α-LA-OA的抗肿瘤机制提供依据。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种乳白蛋白-油酸复合物(α-LA-OA)的制备方法，包括以下步骤：将α-LA溶于pH8.0的磷酸缓冲液中，使α-LA的终浓度为1mM，然后加入OA，其中，α-LA和OA的摩尔比为1：30，混匀后放入45℃恒温水浴摇床，反应20min；4℃、12000×g离心15min，再将未与蛋白结合的OA剔除，置于4℃保存，即得到所述α-LA-OA。进一步的，所述乳白蛋白包括人α-如白蛋白和牛α-如白蛋白。本专利技术的另一方面为：所述的乳白蛋白-油酸复合物(α-LA-OA)在制备抑制肿瘤细胞能量代谢的药物中的应用。进一步的，所述肿瘤细胞为肝癌细胞。进一步的，所述α-LA-OA通过抑制糖酵解和线粒体的有氧呼吸途径抑制肿瘤细胞的能量代谢。进一步的，所述α-LA-OA通过减弱HepG2细胞葡萄糖代谢途径中ATP的产生，从而达到抑制肿瘤细胞能量代谢的作用。进一步的，所述α-LA-OA通过激活mTORC2信号通路，抑制葡萄糖代谢途径中关键酶的活性，从而降低ATP的产生抑制肿瘤细胞的能量代谢。进一步的，所述关键酶包括己糖激酶Ⅱ、醛缩酶、丙酮酸激酶Ⅱ、乳酸脱氢酶B、柠檬酸合成酶、乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶Ⅱ和琥珀酸脱氢酶A。本专利技术相比现有技术的有益效果为：1、本专利技术首先利用裸鼠异种移植瘤模型，体内探究α-LA-OA对糖酵解过程及线粒体有氧呼吸过程的影响。结果显示，α-LA-OA能够抑制肿瘤细胞的糖酵解过程，降低线粒体有氧呼吸过程对氧气的消耗量及ATP的产生量。由此表明，α-LA-OA能够通过抑制糖酵解和线粒体的有氧呼吸途径抑制肿瘤细胞的能量代谢；2、本专利技术为了进一步验证α-LA-OA对肿瘤细胞能量代谢的抑制作用，利用HepG2细胞模型，体外探究α-LA-OA对葡萄糖代谢途径中ATP产生的影响。结果显示，α-LA-OA能够显著降低糖酵解及线粒体有氧呼吸途径中ATP的产生速率。表明α-LA-OA能够减弱HepG2细胞葡萄糖代谢途径中ATP的产生，从而达到抑制肿瘤细胞能量代谢的作用；3、最后，本专利技术为了探究α-LA-OA抑制肿瘤细胞能量代谢的机制，利用HepG2肿瘤细胞模型，首先验证α-LA-OA作用下能量代谢重要途径mTORC2信号通路靶蛋白的表达，进而对葡萄糖的吸收以及糖酵解和TCA循环中关键酶的表达进行检测。结果显示，α-LA-OA能显著促进mTORC2靶蛋白Rictor、mSin1以及下游蛋白Ser473-Akt的表达；但在α-LA-OA作用下，葡萄糖转运蛋白GLUT4的表达量及葡萄糖的吸收量无显著变化；而糖酵解途径中己糖激酶Ⅱ、醛缩酶、丙酮酸激酶Ⅱ、乳酸脱氢酶B以及TCA循环中柠檬酸合成酶、乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶Ⅱ、琥珀酸脱氢酶A的表达量显著降低。由此表明，α-LA-OA能够激活mTORC2信号通路，抑制葡萄糖代谢途径中关键酶的活性，从而降低ATP的产生抑制肿瘤细胞的能量代谢。附图说明图1为α-LA-OA对裸鼠异种移植瘤体积的变化示意图；其中，A为α-LA-OA处理前，B为α-LA-OA处理后；1-3为老鼠编号；图2为α-LA-OA对裸鼠异种移植瘤细胞胞外酸化率的影响示意图；图3为α-LA-OA对裸鼠异种移植瘤细胞糖酵解及糖酵解能力的影响示意图；图4为α-LA-OA对裸鼠异种移植瘤细胞耗氧率的影响示意图；图5为α-LA-OA对裸鼠异种移植瘤细胞后基础耗氧及ATP产生量的影响示意图；图6为CCK-8法检测α-LA-OA对HepG2细胞的活力的影响示意图；图7为不同浓度的α-LA-OA对HepG2细胞的耗氧率的影响示意图；图8为不同浓度的α-LA-OA对HepG2胞外酸化率的影响示意图；图9为不同浓度的α-LA-OA对HepG2细胞ATP产生速率的影响示意图；图10为α-LA-OA作用时间对HepG2后细胞的耗氧率的影响示意图；图11为α-LA-OA作用不同时间对HepG2细胞胞外酸化率的影响示意图；图12为α-LA-OA作用不同时间对HepG2细胞ATP产生速率的影响示意图；图13为α-LA-OA对HepG2细胞Rictor表达的影响示意图图14为α-LA-OA对HepG2细胞mSin1表达的影响示意图；图15为α-LA-OA对HepG2细胞GLUT4表达的影响示意图；图16为α-LA-OA对HepG2细胞葡萄糖吸收的影响示意图；图17为α-LA-OA对HepG2细胞糖酵解过程关键酶的影响示意图；图18为α-LA-OA对HepG2细胞三羧酸循环过程关键酶的影响示意图。具体实施方式实施例1——α-LA-OA的制备本实施例提供了乳白蛋白-油酸复合物(α-LA-OA)的制备方法，包括以下步骤：将α-LA溶于pH8.0的磷酸缓冲液中，使α-LA的终浓度为1mM，然后加入OA，其中，α-LA和OA的摩尔比为1：30，混匀后放入45℃恒温水浴摇床，反应20min；4℃、12000×g离心15min，再将未与蛋白结合的OA剔除，置于4℃保存，即得到所述α-LA-OA。实施例2——α-LA-OA对裸鼠异种移植瘤能量代谢的影响实验动物：BALB/c裸鼠，雌性未孕，健康成熟，4-5周，SPF级。肿瘤动物模型的成立：裸鼠适应性饲养5-7天后，取对数生长期的肝癌细胞，胰酶消化后，用PBS配制成细胞悬液，每只裸鼠接种细胞量为3×106个，在无菌条件下，皮下注射于裸鼠的头部、尾部，每只接种体积为100-200μL。接种完细胞后，每天观察细胞状态，待肿瘤体积为1cm2左右时开始对老鼠进行药物处理。每只裸鼠本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种乳白蛋白-油酸复合物(α-LA-OA)的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：/n将α-LA溶于pH8.0的磷酸缓冲液中，使α-LA的终浓度为1mM，然后加入OA，其中，α-LA和OA的摩尔比为1：30，混匀后放入45℃恒温水浴摇床，反应20min；4℃、12000×g离心15min，再将未与蛋白结合的OA剔除，置于4℃保存，即得到所述α-LA-OA。/n

【技术特征摘要】
1.一种乳白蛋白-油酸复合物(α-LA-OA)的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
将α-LA溶于pH8.0的磷酸缓冲液中，使α-LA的终浓度为1mM，然后加入OA，其中，α-LA和OA的摩尔比为1：30，混匀后放入45℃恒温水浴摇床，反应20min；4℃、12000×g离心15min，再将未与蛋白结合的OA剔除，置于4℃保存，即得到所述α-LA-OA。


2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述乳白蛋白包括人α-如白蛋白和牛α-如白蛋白。


3.如权利要求1或2所述的乳白蛋白-油酸复合物(α-LA-OA)在制备抑制肿瘤细胞能量代谢的药物中的应用。


4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为肝...

【专利技术属性】
技术研发人员：任发政，杨志轩，冷小京，方冰，李依璇，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11