一种环状芽孢杆菌分离鉴定方法技术

本发明专利技术提供了一种环状芽孢杆菌分离鉴定方法，包括以下步骤：(1)使用选择性增菌培养基对含有环状芽孢杆菌的环境菌进行选择性增菌培养，降低非环状芽孢杆菌增殖，使环状芽孢杆菌高效增殖，所述选择性增菌培养基为含有头孢菌素类抗生素和青霉素钾的改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基；(2)将步骤(1)所得菌液在含有抗生素的哥伦比亚血琼脂平板培养，对出现溶血环的菌株进行分离，根据菌落形态进行鉴别。所述方法可进一步使用分子生物学方法对步骤(2)分离得到的菌株进行鉴定。本发明专利技术可简单快速的从环境菌对环状芽孢杆菌进行分离鉴定，具有较高的筛查精度。

A method for isolation and identification of Bacillus annularis

The invention provides a method for isolation and identification of cyclobacillus, which comprises the following steps: (1) selective enrichment culture of environmental bacteria containing cyclobacillus is carried out by using selective enrichment culture medium, which can reduce the proliferation of non cyclobacillus and make cyclobacillus efficiently proliferate. The selective enrichment culture medium is an improved trypsin containing cephalosporins antibiotics and penicillin potassium Peptone soybean broth culture medium; (2) culture the bacterial solution obtained in step (1) in Colombian blood agar plate containing antibiotics, isolate the strains with hemolytic ring, and identify them according to the colony morphology. The method can further use the molecular biological method to identify the strains isolated in step (2). The invention can simply and quickly isolate and identify Bacillus annularis from environmental bacteria, and has high screening precision.

【技术实现步骤摘要】
一种环状芽孢杆菌分离鉴定方法
本专利技术属于微生物检测领域，具体涉及一种环状芽孢杆菌分离鉴定方法。
技术介绍
芽孢杆菌属(Bacillus)是一种革兰阳性、有氧或兼性厌氧的内生孢子杆状细菌，因产抗逆性内生孢子，使芽孢杆菌属的微生物能够抵抗各种极端环境，如高温、极酸、极盐，且对各种杀菌剂具有抵抗力。芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌等近50种。常规对芽孢杆菌属的检测方法是根据菌落、菌体特征结合菌种鉴定材料进行判断，而面对表型特征不明显或含有多种微生物的样品时容易出现误判现象，这些传统的微生物鉴定方法不能满足样本检测中的快速、准确的需要。基于DNA序列的特异(引物)分子生物学技术是当今快速、准确鉴定菌种的方法之一。然而，当环境菌中杂菌数量过多时，大大增加了鉴定的工作量，导致工作效率低下。环状芽孢杆菌是一种芽孢杆菌属条件致病菌，常在被土壤污染的食物以及食品包装用纸中筛出。为了保证食品包装用纸安全，对环状芽孢杆菌进行快速高效的分离鉴定具有很强的应用价值和社会意义，目前还没有可简单快速对环状芽孢杆菌从环境菌中进行分离鉴定的方法。
技术实现思路
本专利技术克服现有技术的缺点与不足，提供一种简单快速的环状芽孢杆菌分离鉴定方法。本专利技术具体技术方案如下：一种环状芽孢杆菌分离鉴定方法，包括以下步骤：(1)使用选择性增菌培养基对含有环状芽孢杆菌的环境菌进行选择性增菌培养，降低非环状芽孢杆菌增殖，使环状芽孢杆菌高效增殖，所述选择性增菌培养基为含有头孢菌素类抗生素和青霉素钾的改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基；(2)将步骤(1)所得菌液在含有抗生素的哥伦比亚血琼脂平板培养，对出现溶血环的菌株进行分离，根据菌落形态进行鉴别。本专利技术选择改良胰蛋白大豆肉汤作为基础培养基而不选用芽孢杆菌的增菌培养基，目的是为了降低其他高营养需求的芽孢杆菌的优势增殖。优选的，所述步骤(1)选择性增菌培养基还可以通过高盐和调节pH抑制大部分不耐盐不耐碱细菌的生长，高效增强环状芽孢杆菌增殖。优选的，使用质量百分比7％的NaCl％，调节选择性增菌培养基pH＝8。本专利技术所述头孢菌素类抗生素优选为头孢噻呋或其盐，如所述头孢噻呋钠，优选选择性增菌培养基中头孢噻呋或其盐的含量为50-500μg/mL，青霉素钾含量为10-30U/mL。更优选的的，所述步骤(1)选择性增菌培养基还可以含有多黏菌素和/或萘啶酮酸或其盐，如萘啶酮钠，进一步抑制杂菌的生长。本专利技术使用头孢菌素类抗生素、多黏菌素和/或萘啶酮酸或其盐抑制杂菌生长，使用青霉素钾使环状芽孢杆菌相对于其他芽孢杆菌优势增长，有利于后续的平板分离鉴定。本专利技术所述的环状芽孢杆菌分离鉴定方法，所述步骤(2)抗生素为香豆素类抗生素和/或萘啶酮酸或其盐，如萘啶酮钠。优选的，香豆素类抗生素为新生霉素。本专利技术所述的环状芽孢杆菌分离鉴定方法，所述步骤(1)和(2)的培养温度为36℃，培养24小时。本专利技术所述的环状芽孢杆菌分离鉴定方法，还包括步骤(3)使用分子生物学方法对步骤(2)分离得到的菌株进行鉴定。所述分子生物学方法为现有技术下常规使用的方法，如16SrRNA/rDNA序列分析、随机扩增多态性DNA、基因间重复序列分析技术、变性梯度凝胶电泳标记技术、特异PCR、多重PCR、荧光定量PCR中的一种或几种，优选16SrRNA/rDNA序列分析。本专利技术另一目的在于提供一种环状芽孢杆菌选择性增菌培养基，包括改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基、头孢菌素类抗生素、青霉素钾。改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基为现有技术常规使用的培养基，可以商业购买或者按照配方配制。优选的，环状芽孢杆菌选择性增菌培养基配方为：胰蛋白胨17.0g大豆蛋白胨3.0g磷酸二氢钾(无水)2.5g葡萄糖2.5g氯化钠70g蒸馏水1000.0mL各成分溶于蒸馏水中，加热溶解，121℃灭菌15min，加抗生素备用。添加抗生素：多黏菌素溶液：称取10mg多黏菌素B于10mL灭菌蒸馏水中，振摇混匀，充分溶解后过滤除菌。每1000mL选择性增菌培养基添加10mL多黏菌素溶液。头孢噻呋钠溶液：称取50mg头孢噻呋钠于10mL灭菌蒸馏水中，振摇混匀，充分溶解后过滤除菌。每1000mL培养基添加10mL头孢噻呋钠溶液。萘啶酮酸钠溶液：称取10mg萘啶酮酸于10mL0.05mol/L氢氧化钠溶液中，振摇混匀，充分溶解后过滤除菌。每1000mL培养基添加10mL萘啶酮酸钠溶液。青霉素钾溶液：称取10mg青霉素钾40万U于10mL灭菌蒸馏水中，振摇混匀，充分溶解后过滤除菌。每1000mL培养基添加5mL青霉素钾溶液。本专利技术另一目的在于提高一种用于环状芽孢杆菌分离鉴定的平板培养基，包括哥伦比亚血琼脂、香豆素类抗生素和/或萘啶酮酸或其盐。哥伦比亚血琼脂为现有技术常规使用的培养基，可以商业购买或者按照配方配制。优选的，平板培养基配方为：胰酪蛋白胨12.0g动物组织蛋白消化液5.0g酵母提取物3.0g牛肉提取物3.0g玉米淀粉1.0g氯化钠5.0g琼脂13.5g蒸馏水1000.0mL各成分溶于蒸馏水中，加热溶解，121℃灭菌15min，加无菌脱纤维羊血5mL/100mL及抗生素摇匀后分装备用。添加抗生素：新生霉素0.01g萘啶酮酸钠0.01g。本专利技术优点：本专利技术能够有效、快速从环境菌中筛出环状芽孢杆菌，筛查精度较高。附图说明图1为实施例4PCR扩增电泳结果。图2为实施例4培养24小时后培养状态图片。图3为实施例4菌株测序结果。图4为根据软件MEGA构建的菌株X1的进化树。图5为根据软件MEGA构建的菌株X2的进化树。具体实施方式以下通过实施例说明本专利技术的具体步骤，但不受实施例限制。在本专利技术中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实例并参照数据进一步详细描述本专利技术。应理解，这些实施例只是为了举例说明本专利技术，而非以任何方式限制本专利技术的范围。在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。实施例1：最佳培养条件的确立一般选择性增菌培养基的选择，是在基础培养基的基础上添加其他菌敏感、目标菌不敏感的营养成分或者抗生素成分。本实施例基础培养基为改良胰蛋白大豆肉汤，不选用芽孢杆菌的增菌培养基，是为了降低其他高营养需求的芽孢杆菌的优势增殖。样品的准备：本实验的筛查主体为市场上购买及日常监督抽查及企业送检的食品接触性用纸。对照品：取经实验验证无任何杂菌生长的样品25g，分别添加阳性菌株：环状芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种环状芽孢杆菌分离鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)使用选择性增菌培养基对含有环状芽孢杆菌的环境菌进行选择性增菌培养，降低非环状芽孢杆菌增殖，使环状芽孢杆菌高效增殖，所述选择性增菌培养基为含有头孢菌素类抗生素和青霉素钾的改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基；/n(2)将步骤(1)所得菌液在含有抗生素的哥伦比亚血琼脂平板培养，对出现溶血环的菌株进行分离，根据菌落形态进行鉴别。/n

【技术特征摘要】
1.一种环状芽孢杆菌分离鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用选择性增菌培养基对含有环状芽孢杆菌的环境菌进行选择性增菌培养，降低非环状芽孢杆菌增殖，使环状芽孢杆菌高效增殖，所述选择性增菌培养基为含有头孢菌素类抗生素和青霉素钾的改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基；
(2)将步骤(1)所得菌液在含有抗生素的哥伦比亚血琼脂平板培养，对出现溶血环的菌株进行分离，根据菌落形态进行鉴别。


2.如权利要求1所述的环状芽孢杆菌分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤(1)选择性增菌培养基还含有质量百分比7％的NaCl％。


3.如权利要求1所述的环状芽孢杆菌分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤(1)选择性增菌培养基pH＝8。


4.如权利要求1所述的环状芽孢杆菌分离鉴定方法，其特征在于，所述头孢菌素类抗生素为头孢噻呋或其盐，所述选择性增菌培养基中头孢噻呋或其盐的含量为50-500μg/mL，所述青霉素钾含量为10-30U/mL。


5.如权利要求1所述的环状芽孢杆菌分离鉴定方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈碧霄，周帆，张驰，杨淼，乔玲，韩冰，闻博芹，徐宁，杨洋，王迪，冯诗旸，王灿，李园园，王晓丽，祝晨辰，刘艳容，杨婷婷，杜亚琼，刘秀，吕伟，孙建娜，张辰，刘虹，杜鹃，
申请(专利权)人：南京市产品质量监督检验院，
类型：发明
国别省市：江苏;32