一种乙脑病毒标准品质粒构建引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种乙脑病毒标准品质粒构建引物，该引物包括正向引物和反向引物，同时提供了该引物在乙脑病毒标准品质粒构建中的应用，包括接种培养、乙脑病毒核酸提取、乙脑病毒标准品质粒设计、逆转录PCR反应、乙脑病毒标准品质粒构建的步骤，同时提供了乙脑病毒标准品质粒的定量检测方法。本发明专利技术提供了构建具有特异性好、灵敏度高的乙脑病毒标准品质粒的引物；建立快速定量检测乙脑病毒标准品质粒的方法。

A primer for construction of Japanese encephalitis virus standard quality particle and its application

The invention discloses a primer for constructing standard quality particle of Japanese encephalitis virus, which includes forward primer and reverse primer, and provides the application of the primer in the construction of standard quality particle of Japanese encephalitis virus, including the steps of inoculation culture, nucleic acid extraction of Japanese encephalitis virus, plasmid design of standard product of Japanese encephalitis virus, reverse transcription PCR reaction and construction of standard quality particle of Japanese encephalitis virus, and provides The quantitative detection method of standard quality granules of JE virus was studied. The invention provides a primer for constructing a Japanese encephalitis virus standard quality particle with good specificity and high sensitivity, and a method for quickly and quantitatively detecting the Japanese encephalitis virus standard quality particle.

【技术实现步骤摘要】
一种乙脑病毒标准品质粒构建引物及其应用
本专利技术涉及乙脑病毒标准品质粒构建
，具体涉及一种乙脑病毒标准品质粒构建引物及其应用。
技术介绍
日本脑炎(JE)是由日本脑炎病毒(JEV)引起的媒介传播的人备其思病，通过库蚁叮咬传播，主要是三带喙库蚁。日本脑炎病毒(JEV)属于黄病毒科黄病毒属中的员，包括登革热病毒、黄热病病毒、西尼罗病毒和寨卡病毒。日本脑炎患者可能出现寒颤、鼻炎或腹泻，随后意识模糊，几天后可能出现癫痫或呕吐。对过去十年发病率的最全面估计显示，每年发生6.9万例日本脑炎。乙脑患者传统的常规诊断方法是采用由世界卫生组织推荐的IgM抗体捕获酶联免疫吸附法检测患者血液或脑脊液样本中的抗乙脑IgM抗体。然而，目前对于该种诊断方法存在公认的局限性，该诊断方法的灵敏度低、精确度第，且无法定量检测乙脑病毒的拷贝数。
技术实现思路
本专利技术为了解决上述技术问题，提供了一种乙脑病毒标准品质粒构建引物，该引物包括：正向引物：5’-CCAGGGGAAGCTTTTGAT-3’；反向引物：5’-ACGCGTTGACCGTTGTTA-3’。同时提供了该引物在乙脑病毒标准品质粒构建中的应用，包括以下步骤：(1)接种培养：准备T25细胞培养48小时，弃上清液，PBS清洗两侧，将乙脑病毒接种至细胞面上，加入MEM培养基，恒温吸附1小时，每20分钟晃动细胞面一次；1小时后补加MEM病毒维持液，置相同环境培养箱至4-5天，细胞面出现大面积病变，将病变的细胞放入-80℃冰箱，24小时后解冻于细胞间操作台，用0.22um的滤嘴过滤收集病毒液，分装后-80℃冻存，获得病毒液；(2)乙脑病毒核酸提取；按照试剂盒操作流程提取病毒液中的乙脑病毒基因组RNA；(3)乙脑病毒标准品质粒设计：通过NCBI数据库下载乙脑病毒标准序列，设计出乙脑病毒标准品质粒构建引物，如下：正向引物：5’-CCAGGGGAAGCTTTTGAT-3’，反向引物：5’-ACGCGTTGACCGTTGTTA-3’；(4)逆转录PCR反应：将乙脑病毒基因组RNA通过RT-PCR扩增乙脑病毒PrM蛋白区域，扩增调节：2分钟98℃预变性；10秒98℃，30秒52.6℃，延伸72℃1分钟，循环35个；10分钟72℃延伸；1％的琼脂糖凝胶确认扩增产物，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物；(5)乙脑病毒标准品质粒构建：将PCR产物连接到pMD-19T克隆载体上，转化DH5α感受态细胞后，涂布于含氨苄抗性的LB固态平板，于培养箱37℃过夜培养，挑单个菌进行单克隆，接着进行菌液PCR、提质粒双酶切、测序鉴定，获得乙脑病毒PrM蛋白区目的基因序列鉴定正确的阳性菌株，将序列鉴定正确的阳性菌株进行常规培养，获得乙脑病毒标准品质粒。此外，本专利技术还提供了乙脑病毒标准品质粒的定量检测方法，包括：(1)乙脑病毒标准品质粒的标准曲线方程绘制：将乙脑病毒标准品质粒用无核酸酶的水按梯度稀释至10-9浓度，梯度依次为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9，按推荐反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测标准品质粒扩增效率和特异性，根据实时定量荧光PCR获得乙脑病毒标准品质粒的扩增标准品质粒的标准曲线，同时以得到的Ct值作为X轴，标准品拷贝数log10作为Y轴绘制乙脑病毒标准品质粒的标准曲线，得到乙脑病毒标准品质粒的标准曲线方程为：y＝-0.3246x+11.017，R2＝0.9961。(2)将逆转录PCR反应后得到的病毒液按病毒RNA提取试剂盒获得病毒RNA，随后进行逆转录得到cDNA，将得到的乙脑病毒cDNA按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9梯度稀释，利用构建的乙脑病毒标准品质粒进行实时荧光定量，根据标准品质粒得到的标准曲线方程结合Ct值计算乙脑病毒液中标准品质粒的拷贝数，计算公式如下：本专利技术的有益效果是：1、提供了构建具有特异性好、灵敏度高的乙脑病毒标准品质粒的引物；2、建立一种快速定量检测乙脑病毒标准品质粒的方法。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是乙脑病毒目的片段PrM蛋白区的PCR扩增；图2是构建的乙脑病毒标准品质粒的双酶切鉴定图，图中数字1-5表示标准质粒的酶切条带；图3是乙脑病毒标准品质粒的标准曲线。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。1、材料1.1菌株、载体Vero细胞购自中国医学科学院医学生物学研究所，pMD-19T购自TaKaRa公司，大肠杆菌DH5α购自昆明硕擎生物科技公司，乙脑病毒购自中国医学科学院医学生物学研究所。1.2主要试剂及仪器RNA提取试剂盒购自德国QIAGEN公司，逆转录试剂盒，DNA分子质量标准、loadingbuffer、PCRMIX购于日本TaKaRa公司，质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购于北京TIANGEN公司，荧光定量试剂购于北京TSINGKE公司；CFX96Real-TimePCR仪购自美国ThermoFisher公司，超微量分光光度计购自德国IMPLEN。1.3乙脑病毒标准品质粒构建方法(1)JEV在适应株上的接种培养:准备2瓶T25vero细胞培养48小时，状态良好，致密单层，弃上清，用PBS清洗两次细胞，分为实验组和对照组。将200u1乙脑病毒接种到实验组细胞面上，加入2ml5％的MEM培养基(MEM培养基+5％胎牛血清+1％双抗(PS)+2％谷氨酰胺+2％NaHCO)；对照组加入2.2ml的5％的MEM培养基放置在温度为37C,5％CO2的培养箱，恒温吸附1小时，每20分钟晃动细胞面-次，让病毒均匀吸附。1小时后补加8ml5％的MEM病毒维持液，放相同环境培养箱培养至4～5天，实验组细胞出现大面积病变，将病变的细胞放入-80℃冰箱，第二天拿出解冻于细胞间操作台用0.22um的滤嘴过滤收集病毒液，分装后-80℃冻存，即为获得的病毒液。(2)乙脑病毒标准品质粒的构建；通过NCBI数据库下载JEV标准序列(GenBank:MH258853)，设计特异性引物扩增乙脑病毒PrM蛋白区部分基因序列，正向引物：5’-CCAGGGGAAGCTTTTGAT-3’，反向引物：5’-ACGCGTTGACCGTTGTTA-3’。按照试剂盒操作流程提权病毒液中的基因组RNA.脑病毒基因组RNA通过RT-PCR扩增乙脑病毒PrM蛋白区域，扩增条件:2min98℃预变性；10s98℃，30s52.6℃,延伸72℃1min,进行循环35个；10min72C延伸。1％的琼脂糖凝胶确认扩增产物，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物，再将回收产物连接到pMD-19T克隆载体上,转化DH5α感受态细胞后，涂布于含氨苄(AMP)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种乙肝病毒标准品质粒构建引物，其特征在于，包括：正向引物：5’‑CCAGGGGAAGCTTTTGAT‑3’；反向引物：5’‑ACGCGTTGACCGTTGTTA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种乙肝病毒标准品质粒构建引物，其特征在于，包括：正向引物：5’-CCAGGGGAAGCTTTTGAT-3’；反向引物：5’-ACGCGTTGACCGTTGTTA-3’。2.一种乙肝病毒标准品质粒构建引物在乙肝病毒标准品质粒构建中的应用。3.一种乙肝病毒标准品质粒构建引物的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)接种培养：准备T25细胞培养48小时，弃上清液，PBS清洗两侧，将乙脑病毒接种至细胞面上，加入MEM培养基，恒温吸附1小时，每20分钟晃动细胞面一次；1小时后补加MEM病毒维持液，置相同环境培养箱至4-5天，细胞面出现大面积病变，将病变的细胞放入-80℃冰箱，24小时后解冻于细胞间操作台，用0.22um的滤嘴过滤收集病毒液，分装后-80℃冻存，获得病毒液；(2)乙脑病毒核酸提取；按照试剂盒操作流程提取病毒液中的乙脑病毒基因组RNA；(3)乙脑病毒标准品质粒设计：通过NCBI数据库下载乙脑病毒标准序列，设计出乙脑病毒标准品质粒构建引物，如下：正向引物：5’-CCAGGGGAAGCTTTTGAT-3’，反向引物：5’-ACGCGTTGACCGTTGTTA-3’；(4)逆转录PCR反应：将乙脑病毒基因组RNA通过RT-PCR扩增乙脑病毒PrM蛋白区域，扩增调节：2分钟98℃预变性；10秒98℃，30秒52.6℃，延伸72℃1分钟，循环35个；10分钟72℃延伸；1％的琼脂糖凝胶确认扩增产物，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物；(5)乙脑病毒标准品质粒构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：张桢，孙强明，蒋鸿超，马静，何文姬，饶清，王明英，王美芬，杜廷义，樊茂，沈茹，赵春灿，
申请(专利权)人：昆明市儿童医院，
类型：发明
国别省市：云南,53