一种基于特有识别序列的绝对定量转录组文库构建方法技术

本发明专利技术公开了一种基于特有识别序列的绝对定量转录组文库构建方法。以片段化mRNA为模板，使用带有通用接头序列的引物池在逆转录酶的作用下合成第一条cDNA链，利用酶促反应在合成的cDNA 3’端加上带有特有识别UID序列的建库接头，使每一条cDNA带有唯一的序列标签；最后，利用通用建库接头进行PCR扩增，获得RNA文库。本发明专利技术首次使用夹板连接法基于单链cDNA构建RNA文库，同时使用UID序列精确还原PCR扩增前的cDNA组成，可实现对转录本的精确定量；本发明专利技术使用单链cDNA为原料进行文库构建，省去了第二链合成的步骤、降低了模板损失率，节省了成本和时间，彻底解决现有技术只能对转录本相对定量的不足。

A construction method of absolute quantitative transcriptome Library Based on unique recognition sequence

【技术实现步骤摘要】
一种基于特有识别序列的绝对定量转录组文库构建方法
本专利技术属于基因测序
，具体涉及一种基于特有识别序列UID的绝对定量转录组文库构建方法。
技术介绍
mRNA占细胞总RNA的3％左右，但由于其最终翻译成蛋白质，参与物种的表型构成，一直是研究的焦点。近十年来，二代测序的高速发展推动着生命科学的不断进步，伴随着二代测序技术的大规模应用，研究者对生命科学领域的认识也更加深入。与基因组相比，转录组包含了时间和空间的限定，而且转录组远小于基因组，相同覆盖倍数的情况下，所需的测序数据量也远远小于基因组所需数据量，使得转录组测序成为更经济、更有效的研究方案。Duplication指测序数据中reads的重复。测序文库构建过程中，通常会进行10轮左右的PCR扩增循环，然后上机测序，扩增引入重复。另一方面，建库时的RNA随机打断也能产生长度和序列完全一致的片段，这部分重复片段可称为天然重复(真重复)，这与PCR扩增重复(假重复)存在本质区别，需要区分。同时扩增过程是不均一的，容易PCR扩增的模板分子会得到更多的扩增片段，即更高的duplication。这导致基因表达定量不准确。然而目前的常规转本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种带有特有识别序列UID的建库接头，其特征在于：为UID‑5a和UID‑5b通过退火形成部分双链及部分单链的接头，其中UID‑5a的序列从5’到3’依次为illumina/Life文库PCR引物的识别序列5a序列、UID序列、anchor序列、5~10个随机碱基N和3’NH2修饰；其中5a序列与5b序列互补配对，UID序列为5~10个随机碱基N，anchor序列为4~10个固定的碱基，用于确定UID序列的位置，N为四种碱基A、T、C、G中的任意一种；UID‑5b的序列从5’到3’依次为5’PO4修饰、anchor’序列、UID’序列和5b序列；其中anchor’序列与anchor序列互补...

【技术特征摘要】
1.一种带有特有识别序列UID的建库接头，其特征在于：为UID-5a和UID-5b通过退火形成部分双链及部分单链的接头，其中UID-5a的序列从5’到3’依次为illumina/Life文库PCR引物的识别序列5a序列、UID序列、anchor序列、5~10个随机碱基N和3’NH2修饰；其中5a序列与5b序列互补配对，UID序列为5~10个随机碱基N，anchor序列为4~10个固定的碱基，用于确定UID序列的位置，N为四种碱基A、T、C、G中的任意一种；UID-5b的序列从5’到3’依次为5’PO4修饰、anchor’序列、UID’序列和5b序列；其中anchor’序列与anchor序列互补配对，UID’序列与UID序列互补配对，5b序列与5a序列互补配对；UID-5a和UID-5b通过退火形成UID-5a的3’末端突出的部分双链结构；反应溶液中的建库接头为混合物。2.一种基于特有识别序列UID的绝对定量转录组文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1）从生物样品中分离所述RNA样品；2）RNA片段化：使用高温离子打断法将RNA片段化，获得长度约为200~500bp的RNA片段；3）逆转录合成cDNA：使用随机通用引物池进行所述RNA片段的逆转录，随机通用引物的序列从5’到3’依次为一段通用接头序列和一段随机序列，其中随机序列为4~10个随机碱基N，N为四种碱基A、T、C、G中的任意一种，引物池中为随机通用引物的混合物；4）使用夹板连接法连接接头：使用T4连接酶将权利要求1所述的带有特有识别序列UID的建库接头连接到步骤3）的cDNA片段的3’端；5）文库扩增：以步骤4）加了UID接头的cDNA为模板，用上下游引物对进行PCR扩增；所述上游引物PCR-F-primer的3’端序列与步骤4）的建库接头的5b序列互补配对，下游引物PCR-R-primer的3’端序列与步骤3）的随机通用引物的通用接头序列配对的，且带有区别不同样本的index。3.根据权利要求2所述的基于特有识别序列UID的绝对定量转录组文库构建方法，其特征在于，步骤3）中使用的随机通用引物的序列如SEQIDNO：1所示，步骤4）中带有特有识别序列UID的建库接头的UID-5a的序列如SEQIDNO：2所示，其带有3’NH2修饰，UID-5b的序列如SEQIDNO：3所示，其带有5’PO4修饰；步骤5）使用的上游引物PCR-F-primer的序列如SEQIDNO：4所示，下游引物PCR-R-primer的序列如SEQIDNO：5所示。4.根据权利要求2所述的基于特有识别序列UID的绝对定量转录组文库构建方法，其特征在于，步骤1）所...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴启家，王琳，蒋菁菁，
申请(专利权)人：武汉康测科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42