一种快速检测爪哇根结线虫的LAMP引物及其应用、检测方法技术

本发明专利技术涉及植物病原检测技术领域，特别涉及一种快速检测爪哇根结线虫的LAMP引物及其应用和检测方法。所述引物包括正向外引物Mj‑F3、反向外引物Mj‑B3、正向内引物Mj‑FIP和反向内引物Mj‑BIP；引物核苷酸序列依次如SEQ ID NO.2～5所示。基于该引物建立了LAMP检测方法，可应用于线虫样品、植物根组织样品和土壤样品中爪哇根结线虫的快速检测和鉴定，具有特异性强、灵敏度高、仪器设备简单、操作简便、快速高效、结果判定可视化等优点，在爪哇根结线虫现场快速检测和爪哇根结线虫病的早期诊断及指导科学用药等方面具有很高的推广应用价值。

A lamp primer for rapid detection of Meloidogyne javanica and its application and detection method

The invention relates to the technical field of plant pathogen detection, in particular to a lamp primer for rapid detection of Meloidogyne javanica and its application and detection method. The primers include the forward external primer MJ \u2011 F3, the reverse external primer MJ \u2011 B3, the forward internal primer MJ \u2011 FIP and the reverse internal primer MJ \u2011 BiP; the nucleotide sequence of the primers is shown in sequence as SEQ \u2011 ID \u2011 no.2-5. Based on the primer, lamp detection method was established, which can be used to detect and identify the root knot nematodes in nematode samples, plant root tissue samples and soil samples. It has the advantages of strong specificity, high sensitivity, simple instrument and equipment, simple operation, fast and efficient, visual results, etc. it can be used to detect the root knot nematodes in the field and early diagnosis of the disease It has a high value of popularization and application in guiding scientific drug use.

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测爪哇根结线虫的LAMP引物及其应用、检测方法
本专利技术涉及植物病原检测
，特别涉及一种快速检测爪哇根结线虫的LAMP引物及其应用和检测方法。
技术介绍
根结线虫(Meloidogynespp.)是一类世界性分布的威胁农业生产的植物根系专性内寄生线虫，可侵染114个科3000多种植物，每年因其危害可造成世界农作物减产至少5％。目前，世界上报道根结线虫的种类已超过100个种，其中，爪哇根结线虫(M.javanica)是分布最广、危害最重、最常见的根结线虫种类之一，具有非常广泛的寄主范围，可侵染蔬菜、果树、药材、花卉、林木等植物，给我国农业生产造成了重大的经济损失。快速、准确地鉴定和检测根结线虫的种类，对根结线虫病害的田间检测和监测及选择有效的防控方法至关重要。根结线虫种类鉴定和检测方法主要包括传统的形态学鉴定和以PCR为基础的分子诊断方法。形态学鉴定主要以2龄幼虫和雄虫头部、尾部及雌虫会阴花纹形态作为鉴别的主要依据，但由于根结线虫种类较多，各种类在种间的形态学特征上非常相似，在种内又存在着较大的变异，通过形态学特征难以准确鉴定，并且该方法耗时、费力，需要专业的技能和丰富的线虫形态学鉴定经验，难以达到快速诊断和检测的目的。虽然PCR检测方法在一定程度上克服了形态学鉴定上的缺陷，但需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统等昂贵的仪器设备，检测过程复杂、时间较长，不利于现场快速检测及基层普及应用。目前还没有通过直接提取土壤DNA和反应完成后无需开盖而快速可视化检测土壤中爪哇根结线虫的LAMP方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术克服现有爪哇根结线虫检测鉴定技术的不足，提供一种可以从植物组织样品和土壤样品中快速检测爪哇根结线虫的LAMP引物和简便实用的检测方法。该方法仅需要使用恒温水浴即可完成检测，通过肉眼观察即可准确、高效、简便和快速地判定样品中是否含有爪哇根结线虫。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了引物组合，包括正向外引物Mj-F3、反向外引物Mj-B3、正向内引物Mj-FIP和反向内引物Mj-BIP；所述正向外引物Mj-F3的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述反向外引物Mj-B3的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；所述正向内引物Mj-FIP的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述反向内引物Mj-BIP的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是一种新型的体外等温扩增核酸技术，该技术依赖于能识别靶基因序列上6～8个区域的4～6条特异性引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在等温条件下(60～65℃)保温30～90min，就可快速完成核酸的大量扩增。扩增产物可以通过荧光目测比色、琼脂糖凝胶电泳、焦磷酸镁浊度、横向流动试纸条等方法检测。由于该技术不需要专业的仪器设备，在普通的水浴锅或简单的恒温器中即可完成，具有操作简单、快速、特异性强、灵敏度高、检测方便等优点，已广泛应用于真菌、细菌、病毒、寄生虫等方面的检测。在上述研究的基础上，本专利技术还提供了所述的引物组合在检测爪哇根结线虫中的应用。在本专利技术的一些具体实施方案中，待测样品为线虫样品、植物根组织样品和/或土壤样品。本专利技术还提供了所述的引物组合在制备爪哇根结线虫检测试剂或试剂盒中的应用。本专利技术还提供了一种爪哇根结线虫的LAMP检测方法，包括以下步骤：步骤1、提取待测样品的DNA；步骤2、以所述待测样品的DNA为模板，利用本专利技术所述的引物组合，建立LAMP反应体系，进行LAMP扩增；步骤3、根据步骤2中LAMP扩增的反应结果判定所述待测样品中是否含有爪哇根结线虫；所述判定标准为：(1)向所述LAMP扩增的产物中加入显色剂，如果所述LAMP扩增的产物呈绿色，则检测结果为阳性，表明所述待测样品中含有爪哇根结线虫；如果所述LAMP扩增的产物呈橙色，则检测结果为阴性，表明所述待测样品中不含有爪哇根结线虫；或(2)取所述LAMP扩增的产物于2％琼脂糖凝胶中电泳，在紫外光下进行检测，如果出现梯状条带，表明所述待测样品中含有爪哇根结线虫；如果未出现梯状条带，表明所述待测样品中不含有爪哇根结线虫。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述LAMP反应体系为25μL，包括1μLDNA模板，0.2μmol/L正向外引物(Mj-F3)，0.2μmol/L反向外引物(Mj-F3)，1.6μmol/L正向内引物(Mj-FIP)，1.6μmol/L反向内引物(Mj-FIP)，1.2mmol/LdNTPs，6mmol/LMgSO4，20mmol/LTris-HCl(pH8.8)，10mmol/LKCl，10mmol/L(NH4)2SO4，0.1％TritonX-100，8UBstDNA聚合酶，余量用ddH2O补足。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述显色剂包括体积比为1:9的SYBRgreenI与PCR级DMSO的混合物。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述显色剂的加入时机为：步骤2中所述建立LAMP反应体系之后、LAMP扩增之前，在PCR管内盖上加入1μL显色剂。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述LAMP扩增的反应条件为：60℃～65℃保温30～90min。本专利技术还提供了一种快速检测爪哇根结线虫的LAMP试剂盒，包括如权利要求1所述的引物组合。本专利技术具有以下有益效果：(1)特异性强。本专利技术提供了一种快速检测爪哇根结线虫的LAMP引物，该引物是根据爪哇根结线虫SCAR标记序列中的6个不同区域设计筛选出4条特异性引物，比仅识别靶序列2个区域的常规PCR检测方法特异性强。(2)灵敏度高。本专利技术建立的爪哇根结线虫LAMP检测方法灵敏度高，可检测到0.0001头爪哇根结线虫雌虫，以及在0.5g土壤中可检测到0.01条爪哇根结线虫2龄幼虫，比常规PCR的检测灵敏度高10～100倍。(3)检测快速、简便易行。本专利技术建立的爪哇根结线虫LAMP检测方法可以直接检测植物组织和土壤样品中的爪哇根结线虫。DNA提取简便快速，不需要对待检测的植物组织和土壤样品进行线虫分离、形态学鉴定及挑虫等步骤，直接提取植物组织和土壤样品DNA进行快速检测，从提取DNA到获得检测结果仅需要2h左右。(4)设备简单，方法操作简便。本专利技术建立的爪哇根结线虫LAMP检测方法对仪器设备要求低，不需要显微镜、PCR仪、凝胶电泳和成像系统等昂贵仪器，只需要一个简单的恒温器或水浴锅即可完成检测，利于现场快速检测和基层应用。(5)结果判定可视化。本专利技术建立的爪哇根结线虫LAMP检测方法采用扩增反应前在PCR管内盖上加入荧光染料，反应结束后通过离心与扩增产物混合，通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，实现了无需开盖的样品快速可视化检测，避免了反应完成后，开盖加入荧光染料而造成的气溶胶污染问题。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为三组爪哇根结线虫LAMP引物在不同反应温度条件下的扩增结果图；图2为爪哇根结线虫SCAR标记序列的最佳LAMP引物设计示意图；图3为本专利技术实施例2中LAMP荧光检测结果图；图4为本专利技术实施例2中LAMP电泳检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.引物组合，其特征在于，包括正向外引物、反向外引物、正向内引物和反向内引物；所述正向外引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述反向外引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述正向内引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述反向内引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

【技术特征摘要】
1.引物组合，其特征在于，包括正向外引物、反向外引物、正向内引物和反向内引物；所述正向外引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述反向外引物的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；所述正向内引物的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述反向内引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示。2.如权利要求1所述的引物组合在检测爪哇根结线虫中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，待测样品为线虫样品、植物根组织样品和/或土壤样品。4.如权利要求1所述的引物组合在制备爪哇根结线虫检测试剂或试剂盒中的应用。5.一种爪哇根结线虫的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、提取待测样品的DNA；步骤2、以所述待测样品的DNA为模板，利用如权利要求1所述的引物组合，建立LAMP反应体系，进行LAMP扩增；步骤3、根据步骤2中LAMP扩增的反应结果判定所述待测样品中是否含有爪哇根结线虫；所述判定标准为：(1)向所述LAMP扩增的产物中加入显色剂，如果所述LAMP扩增的产物呈绿色，则检测结果为阳性，表明所述待测样品中含有爪哇根结线虫；如果所述LAMP扩增的产物呈橙色，则检测结果为阴性，表明所述待测样品中不含有爪哇根结线虫；或(2)取所述LAMP扩增的产物于2％琼脂糖凝胶中电泳，在紫外光下进行检测，...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋志强，梅时勇，杨喜爱，张晓伟，肖清明，肖爱平，冷娟，
申请(专利权)人：中国农业科学院麻类研究所，
类型：发明
国别省市：湖南,43