一种牛支原体灭活疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种牛支原体灭活疫苗及其制备方法和应用，属于微生物和生物制品技术领域。所述牛支原体灭活疫苗至少包括灭活的牛支原体(Mycoplasma bovis)16M株及疫苗佐剂。本发明专利技术从牛支原体灭活疫苗的制备的BEI灭活条件、牛支原体灭活疫苗的免疫方式和牛支原体灭活疫苗使用的佐剂及临床应用上进行探究，探寻出了最佳的牛支原体BEI灭活条件、牛支原体灭活疫苗的免疫方式和免疫佐剂，从而成功制备一种牛支原体灭活疫苗，该牛支原体灭活疫苗在临床应用中显示出良好的保护效果，具有良好的应用推广价值。

A inactivated vaccine of Mycoplasma bovis and its preparation and Application

The invention provides a inactivated vaccine of Mycoplasma bovis and a preparation method and application thereof, belonging to the technical field of microorganisms and biological products. The inactivated vaccine of Mycoplasma bovis at least includes the inactivated Mycoplasma bovis 16m strain and vaccine adjuvant. The invention explores from the following aspects: the Bei inactivation condition for the preparation of the inactivated vaccine of Mycoplasma bovis, the immune mode of the inactivated vaccine of Mycoplasma bovis, the adjuvant used for the inactivated vaccine of Mycoplasma bovis and its clinical application, and explores the best inactivated condition of Mycoplasma bovis, the immune mode and the immune adjuvant of the inactivated vaccine of Mycoplasma bovis, so as to successfully prepare a inactivated vaccine of Mycoplasma bovis The inactivated vaccine shows good protective effect in clinical application and has good application and promotion value.

【技术实现步骤摘要】
一种牛支原体灭活疫苗及其制备方法和应用
本专利技术属于微生物和生物制品
，具体涉及一种牛支原体灭活疫苗及其制备方法和应用。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。牛支原体(Mycoplasmabovis)是引起牛呼吸道炎症、乳腺炎和关节炎等多种症状的重要病原体之一。自1961年，Hale等人首次从美国乳汁中分离得到牛支原体后，世界各地陆续分离到牛支原体。2008年，我国首次在肉牛中暴发牛支原体肺炎疫情，此后相继在湖北、贵州、宁夏、内蒙古、广西、重庆等地区的转运犊牛中发现该病，发病率为50％～100％，病死率高达10％-50％，给我国养牛业造成了巨大的经济损失。一般而言，难以治疗牛支原体感染的原因在于它们缺乏细胞壁，这使得多数常用的广谱抗生素对它们无效。而且牛支原体的免疫机制非常复杂且特殊，至今尚未完全清楚。研究表明牛支原体与宿主免疫细胞相互作用能产生两种现象：免疫增强和免疫抑制。由于牛支原体基因的DNA高频率重组，表面脂蛋白具有高度的特异性，这就使牛支原体表型多变，也使得国内外有关疫苗的研究进程缓慢，只有美国将商品化的牛支原体疫苗投放市场。美国虽有两种商品化疫苗，但是在2011年，对这两种疫苗进行的犊牛免疫保护试验表明，两种疫苗中一种可以明显提高抗体水平，但是对牛的保护率约44％，而另一种疫苗的免疫效果不显著。因此目前，国内外市场上急需一种有效的商品化牛支原体疫苗，以控制牛支原体的流行和危害，提高犊牛和转运牛只成活率。专利技术内容针对上述现有技术，本专利技术提供一种牛支原体灭活疫苗及其制备方法和应用。本专利技术通过优化筛选疫苗制备条件，从而成功制备一种牛支原体灭活疫苗，该牛支原体灭活疫苗在临床应用中显示出良好的保护效果，极具市场推广应用之价值。本专利技术是通过如下技术方案实现的：本专利技术的第一个方面，提供一种牛支原体灭活疫苗，所述牛支原体灭活疫苗至少包括灭活的牛支原体及疫苗佐剂。其中，所述牛支原体为牛支原体(Mycoplasmabovis)16M株，保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，保藏日期为2019年4月4日，保藏号为CCTCCNO:M2019235。进一步的，所述疫苗佐剂至少包括206佐剂和CpG免疫增强剂。本专利技术的第二个方面，提供上述牛支原体灭活疫苗的制备方法，所述方法至少包括：将牛支原体(Mycoplasmabovis)16M株灭活后，加入CpG免疫增强剂混匀后再加入206佐剂。其中，所述牛支原体(Mycoplasmabovis)16M株灭活具体方法包括：将牛支原体(Mycoplasmabovis)16M接种至改良Thiaucourt's培养基中培养后传代培养；加入二乙烯亚胺(BEI)灭活，得灭活牛支原体(Mycoplasmabovis)16M株培养物。本专利技术的第三个方面，提供上述牛支原体灭活疫苗在制备预防和/或治疗牛支原体感染引起的疾病的药物中的应用。本专利技术有益效果：本专利技术提供一种牛支原体灭活疫苗及其制备方法和应用。本专利技术从牛支原体灭活疫苗的制备的BEI灭活条件、牛支原体灭活疫苗的免疫方式和牛支原体灭活疫苗使用的佐剂及临床应用上进行探究，探寻出了最佳的牛支原体BEI灭活条件、牛支原体灭活疫苗的免疫方式和免疫佐剂，成功制备一种牛支原体灭活疫苗，该牛支原体灭活疫苗在实际临床应用中显示出良好的保护效果，同时本专利技术牛支原体灭活疫苗具有制备简单、成本相对低、对动物体刺激性小、安全有效等优点，推广后可望产生巨大的经济效益和社会效益。附图说明构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。图1为实施例1中不同浓度BEI灭活剂对牛支原体的灭活效果图。图2为实施例2中不同佐剂疫苗免疫后抗体消长规律图。图3为实施例2中不同佐剂疫苗免疫14天后PBMC增殖水平测定图。图4为实施例3中不同免疫方式免疫后抗体消长规律图。图5为实施例4中免疫攻毒组肺脏大体病变图：肺脏表面无明显的实变区域。图6为实施例4中空白攻毒组肺脏大体病变图：肺脏表面存在明显的实变区域(箭头指示部位)。图7为实施例4中免疫攻毒组肺脏病理学观察图：肺泡结构完整、肺泡壁无明显增厚，肺间质无增生，200×。图8为实施例4中空白攻毒组肺脏病理学观察图：肺泡塌陷、肺泡壁明显增厚，肺间质增生，肺泡腔内有少量细胞脱落，200×。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本专利技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。如前所述，目前，国内外市场上急需一种有效的商品化牛支原体疫苗，以控制牛支原体的流行和危害，提高犊牛和转运牛只成活率。有鉴于此，本专利技术的一个具体实施方式中，提供一种牛支原体灭活疫苗，所述牛支原体灭活疫苗至少包括灭活的牛支原体及疫苗佐剂。本专利技术的又一具体实施方式中，所述牛支原体为牛支原体(Mycoplasmabovis)16M株，保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，保藏日期为2019年4月4日，保藏号为CCTCCNO:M2019235。该牛支原体16M株是从山东某牛场有气喘等特征的犊牛中进行牛支原体病原学检测，筛选出牛支原体阳性牛只，宰杀剖检后采集具有牛支原体肺炎典型特征病变的犊牛肺脏病变部位，经分离培养、生化鉴定、特异性PCR和16srRNA测序，确定分离菌为牛支原体。经单菌落纯化后，该牛支原体强毒株在PPLO培养基中增殖滴度高，同时可诱发包括气喘、明显肺部实变等多种牛支原体感染典型临床病症，具有较强的致病力，经BEI灭活处理后，依然保持良好的免疫原性。本专利技术的又一具体实施方式中，所述牛支原体灭活疫苗每头份剂量中包含至少4.0×1010CCU的灭活牛支原体(Mycoplasmabovis)16M株。本专利技术的又一具体实施方式中，所述疫苗佐剂至少包括206佐剂和CpG免疫增强剂。本专利技术的又一具体实施方式中，每头份剂量牛支原体灭活疫苗为1-4mL(优选为2mL)。本专利技术的又一具体实施方式中，所述牛支原体灭活疫苗为皮下注射型疫苗、后海穴注射型疫苗或肌注型疫苗，优选为肌注型疫苗；经试验验证，与皮下注射与后海穴注射方式相比，采用肌注方式免疫牛只，其抗体转阳时间较短，抗体峰值水平较高，抗体水平下降较慢，因此肌注为最佳的免疫方式。本专利技术的又一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牛支原体灭活疫苗，其特征在于，所述牛支原体灭活疫苗至少包括灭活的牛支原体和疫苗佐剂；其中，所述牛支原体为牛支原体(Mycoplasma bovis)16M株，保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，保藏日期为2019年4月4日，保藏号为CCTCC NO:M2019235。

【技术特征摘要】
1.一种牛支原体灭活疫苗，其特征在于，所述牛支原体灭活疫苗至少包括灭活的牛支原体和疫苗佐剂；其中，所述牛支原体为牛支原体(Mycoplasmabovis)16M株，保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，保藏日期为2019年4月4日，保藏号为CCTCCNO:M2019235。2.如权利要求1所述的一种牛支原体灭活疫苗，其特征在于，所述牛支原体灭活疫苗每头份剂量中包含至少含有4.0×1010CCU的灭活牛支原体(Mycoplasmabovis)16M株。3.如权利要求1所述的一种牛支原体灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗佐剂至少包括206佐剂和CpG免疫增强剂。4.如权利要求1所述的一种牛支原体灭活疫苗，其特征在于，每头份剂量牛支原体灭活疫苗为1-4mL(优选为2mL)。5.如权利要求1所述的一种牛支原体灭活疫苗，其特征在于，所述牛支原体灭活疫苗为皮下注射型疫苗、后海穴注射型疫苗或肌注型疫苗，优选为肌注型疫苗。6.权利要求1-5任一项所述牛支原体灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法至少包括：将牛支原体(Mycoplasm...

【专利技术属性】
技术研发人员：张亮，杨宏军，王基隆，张云飞，刘来兴，
申请(专利权)人：山东省农业科学院奶牛研究中心，
类型：发明
国别省市：山东,37