本发明专利技术属于两性离子纳米药物载体制备技术领域，公开了PH值响应两性离子的透明质酸空白胶束的制备方法。本发明专利技术选择以天然多糖透明质酸来制备新型两性纳米药物载体，利用透明质酸良好的生物相容性以及可降解性，解决药物在体内残留的问题。该方法操作简单易行、条件温和。本发明专利技术制备的透明质酸两性离子纳米药物载体空白胶束胶束状态稳定，形态为近似球形的纳米颗粒，胶束表面带有负电荷，具有较好的抗蛋白吸附性能。
Preparation of hyaluronic acid blank micelles with pH responsive to zwitterions
【技术实现步骤摘要】
pH值响应两性离子的透明质酸空白胶束的制备方法
本专利技术属于两性离子纳米药物载体制备
，本专利技术具体涉及PH值响应两性离子的透明质酸空白胶束的制备方法。
技术介绍
透明质酸(Hyaluronicacid,HA)，是一种天然的高分子酸性勃多糖，具有良好的生物相容性和生物可降解性，无毒、无免疫原性的聚合物。其自身的竣基和轻基官能团可以通过交联或者偶联反应来化学修饰。因此，作为靶向配体对于肿瘤治疗具有应用前景。为了解决药物治疗恶性肿瘤依然存在药物利用率低、选择性差和多药耐药性等问题，研究开发两性离子纳米药物载体使其具有安全性高、能响应肿瘤特殊微环境刺激并能够控制药物释放的能力。两性离子纳米药物载体，以肿瘤组织独特的酸性微环境为依据，所开发的pH敏感型药物载体能够控制其包载的抗肿瘤药物在到达肿瘤组织后快速释放，增加药物的累积浓度及肿瘤抑制效果，并有效降低药物对生物体的伤害。两性离子纳米颗粒能够随着pH变化发生电荷翻转，具有细胞内环境敏感性。因此，以两性离子构建药物载体可以利用其pH敏感特性对药物控释，提高两性离子载体的血清稳定性，延长血液循环时的停留时间。鉴于常见的两性离子聚合物大多不具有生物降解性，其残留物质会在体内累积，引发不良反应。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，为了解决常见的两性离子聚合物大多不具有生物降解性，其残留物质会在体内累积，从而引发不良反应的问题，本专利技术提供一种PH值响应两性离子的透明质酸空白胶束的制备方法，本专利技术选择以天然多糖透明质酸来制备新型两性纳米药物载体，利用透明质酸良好的生物相容性以及可降解性，解决药物在体内残留的问题。该方法操作简单易行、条件温和。本专利技术制备的透明质酸两性离子纳米药物载体空白胶束胶束状态稳定，形态为近似球形的纳米颗粒，胶束表面带有负电荷，具有较好的抗蛋白吸附性能。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案实现的：PH值响应两性离子的透明质酸空白胶束的制备方法；包括以下步骤：(1)去乙酰化的透明质酸两性离子多糖dHA的制备：制备反应物；100-300mL乙醇对反应物进行沉淀，并在4℃静置6h以上。抽滤后得到沉淀，真空干燥24h以上；然后将中间产物溶于20-30mL冰乙酸中，加入10-20mL碘酸，4℃静置2h以上，然后加入5-10mL氢碘酸搅拌15min以上；反应液用无水乙醚萃取，然后用去离子水透析，将透析液冷冻干燥，得到去乙酰化的透明质酸两性离子多糖dHA；(2)pH值响应两性离子的透明质酸聚合物(dHAD)的制备：取去乙酰化的透明质酸两性离子多糖(dHA)溶于去离子水中，然后加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)作为缩合剂，滴加N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)调节溶液pH值，-4℃冰浴条件下搅拌2h以上；随后将反应温度升至室温，将十二胺溶于四氢呋喃中，缓慢滴加至上述溶液中，在氮气保护条件下，室温反应24h以上；将反应液透析，冻干，得到疏水改性后的pH值响应两性离子的透明质酸聚合物(dHAD)。(3)dHAD胶束的制备：取dHAD溶解在水中，振荡6-12h，使其均匀分散，静置3-6h，即得dHAD胶束。进一步的，所述步骤(1)中制备反应物具体步骤为：称取透明质酸钠和硫酸联氨，随后加入的水合肼溶液进行溶解，氮气保护50-70℃反应72h以上；或者为：称取NaOH，溶于去离子水中，然后加入透明质酸，氮气保护下65-75℃油浴反应6-12h；NaOH为40％NaOH，透明质酸与NaOH的质量比范围是1:20-40。进一步的，所述步骤(1)中透明质酸钠与硫酸联胺的质量比为3-1:1-2，透明质酸钠与水合肼的质量比为1:2-3。进一步的，所述步骤(1)中乙醇为-4℃冰乙醇。进一步的，所述步骤(1)中冰乙酸为质量分数为5％-10％的溶液。进一步的，所述步骤(1)中碘酸的摩尔质量为0.1-1M。进一步的，所述步骤(1)中氢碘酸为质量分数为50％-60％的溶液。进一步的，所述步骤(1)中无水乙醚萃取，无水乙醚与反应液的体积比为1：1。进一步的，所述步骤(2)中DMTMM与dHA的摩尔比为1:1-3。进一步的，所述步骤(2)中DIPEA调节pH值范围为7-8。进一步的，所述步骤(2)中十二胺与dHA的摩尔比为1-3:1-3。进一步的，所述步骤(2)中去离子水和四氢呋喃，二者的体积比为1:1-3。进一步的，所述步骤(3)中dHAD与水的质量比为1-5:1-5。进一步的，所述步骤(1)和(2)中所述的透析，其透析时间均为24-72h。本专利技术与现有技术相比的有益效果是：(1)本专利技术以透明质酸(HA)为原料，通过肼解法制备得到去乙酰化的透明质酸两性离子多糖dHA，然后以能够在水中稳定存在的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)作为缩合剂，连接十二烷基脂肪胺作为疏水尾部，得到具有pH值响应两性离子的透明质酸聚合物dHAD。利用该结构的两性离子聚合物自组装形成胶束，携带抗肿瘤药物进入细胞，达到输送抗肿瘤药无的目的。(2)以两性离子材料构建药物载体可以利用其pH敏感特性对药物控释，提高两性离子载体的血清稳定性，延长血液循环时的停留时间。鉴于常见的两性离子聚合物大多不具有生物降解性，其残留物质会在体内累积，引发不良反应。因此，本专利技术选择以天然多糖透明质酸来制备新型两性离子纳米药物载体，利用透明质酸良好的生物相容性以及可降解性，解决载体在体内残留的问题；利用两性离子聚合物的电荷翻转特性实现对药物控制释放，增强抑制肿瘤细胞增长的效果。附图说明图1为实施例3中HA和dHAD-11红外光谱图。图2为实施例2中(a)HA和(b)dHA-2的1HNMR谱图。图3为实施例5中dHAD-21的1HNMR谱图。图4为实施例3-6中四种dHAD-11、dHAD-12、dHAD-21、dHAD-22胶束的临界胶束浓度。图5为实施例3-6中四种dHAD-11、dHAD-12、dHAD-21、dHAD-22胶束的粒径分布图。图6为实施例3-6中四种dHAD-11、dHAD-12、dHAD-21、dHAD-22胶束的透射电镜图(0.2μm)。图7为实施例3-6中四种dHAD-11、dHAD-12、dHAD-21、dHAD-22胶束在10％FBS条件下的稳定性图。图8为实施例3-6中四种dHAD-11、dHAD-12、dHAD-21、dHAD-22胶束在不同浓度下和Tween80的溶血率图。具体实施方式下面通过具体实施例详述本专利技术，但不限制本专利技术的保护范围。如无特殊说明，本专利技术所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。实施例1去乙酰化的透明质酸两性离子多糖dHA的制备方法；包括以下步骤：去乙酰化的透明质酸两性离子多糖dHA的制备：称取9g透明质酸钠和3g硫酸联氨，随后加入180mL的水合肼溶液进行溶解，氮气保护50℃反应72h。150mL乙醇对反应物进行沉淀，并在4℃静置6h。抽滤后得到沉淀，真空干燥24h。然后将中间产物溶于30mL10％冰乙酸中，加入20mL1M碘酸，4℃静置2h，然后加入10mL60％氢碘酸搅拌30min。用无水乙醚萃取，然后用去离子水透析，将透析液冷冻干燥，得到去乙酰化的透明质酸两性离子多本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.PH值响应两性离子的透明质酸空白胶束的制备方法，其特征是，包括以下步骤：(1)去乙酰化的透明质酸两性离子多糖dHA的制备：制备反应物；100‑300mL乙醇对反应物进行沉淀，并在4℃静置6h以上；抽滤后得到沉淀，真空干燥24h以上；然后将中间产物溶于20‑30mL冰乙酸中，加入10‑20mL碘酸，4℃静置2h以上，然后加入5‑10mL氢碘酸搅拌15min以上；反应液用无水乙醚萃取，然后用去离子水透析，将透析液冷冻干燥，得到去乙酰化的透明质酸两性离子多糖dHA；(2)pH值响应两性离子的透明质酸聚合物dHAD的制备：取去乙酰化的透明质酸两性离子多糖溶于去离子水中，然后加入4‑(4,6‑二甲氧基三嗪‑2‑基)‑4‑甲基吗啉盐酸盐作为缩合剂，滴加N,N‑二异丙基乙胺调节溶液pH值，‑4℃冰浴条件下搅拌2h以上；随后将反应温度升至室温，将十二胺溶于四氢呋喃中，缓慢滴加至上述溶液中，在氮气保护条件下，室温反应24h以上；将反应液透析，冻干，得到pH值响应两性离子的透明质酸聚合物dHAD；(3)dHAD胶束的制备：取dHAD溶解在水中，振荡6‑12h，使其均匀分散，静置3‑6h，即得dHAD胶束；所述步骤(1)中制备反应物具体步骤为：称取透明质酸钠和硫酸联氨，随后加入的水合肼溶液进行溶解，氮气保护50‑70℃反应72h以上；或者为：称取NaOH，溶于去离子水中，然后加入透明质酸，氮气保护下65‑75℃油浴反应6‑12h；NaOH为40％NaOH，透明质酸与NaOH的质量比范围是1:20‑40。...
【技术特征摘要】
1.PH值响应两性离子的透明质酸空白胶束的制备方法，其特征是，包括以下步骤：(1)去乙酰化的透明质酸两性离子多糖dHA的制备：制备反应物；100-300mL乙醇对反应物进行沉淀，并在4℃静置6h以上；抽滤后得到沉淀，真空干燥24h以上；然后将中间产物溶于20-30mL冰乙酸中，加入10-20mL碘酸，4℃静置2h以上，然后加入5-10mL氢碘酸搅拌15min以上；反应液用无水乙醚萃取，然后用去离子水透析，将透析液冷冻干燥，得到去乙酰化的透明质酸两性离子多糖dHA；(2)pH值响应两性离子的透明质酸聚合物dHAD的制备：取去乙酰化的透明质酸两性离子多糖溶于去离子水中，然后加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐作为缩合剂，滴加N,N-二异丙基乙胺调节溶液pH值，-4℃冰浴条件下搅拌2h以上；随后将反应温度升至室温，将十二胺溶于四氢呋喃中，缓慢滴加至上述溶液中，在氮气保护条件下，室温反应24h以上；将反应液透析，冻干，得到pH值响应两性离子的透明质酸聚合物dHAD；(3)dHAD胶束的制备：取dHAD溶解在水中，振荡6-12h，使其均匀分散，静置3-6h，即得dHAD胶束；所述步骤(1)中制备反应物具体步骤为：称取透明质酸钠和硫酸联氨，随后加入的水合肼溶液进行溶解，氮气保护50-70℃反应72h以上；或者为：称取NaOH，溶于去离子水中，然后加入透明质酸，氮气保护下65-75℃油浴反应6-12h；NaOH为40％NaOH，透明质酸与NaOH的质量比范围是1:...
【专利技术属性】
技术研发人员：张树彪，孙姣，陈会英，崔韶晖，支德福，海华，
申请(专利权)人：大连民族大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
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