一种多基因重组干酪乳酸杆菌、制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种多基因重组干酪乳酸杆菌、制备方法及应用，通过T‑A克隆将目的基因分别连入到pMD18‑T，转化至DH5α感受态细胞得到pMD18‑T‑S1、pMD18‑T‑GtxA‑N和pMD18‑T‑flfA，分别以pMD18‑T‑S1、pMD18‑T‑GtxA‑N和pMD18‑T‑flfA为模板进行扩增，得到三条目的片段，将三条目的片段连接为一条片段，PCR扩增pMG36e使其变为线性化载体，通过无缝克隆技术将该片段和线性化载体连接，并将连接产物转化至XL1‑Bule感受态细胞中得到重组质粒，将其电转化入干酪乳酸杆菌中得到重组干酪乳酸杆菌。

【技术实现步骤摘要】
一种多基因重组干酪乳酸杆菌、制备方法及应用
本专利技术属于微生物
，特别涉及一种多基因重组干酪乳酸杆菌、制备方法及应用。
技术介绍
蛋鸡输卵管囊肿一直是危害养禽业的重要疫病，该病以干酪性输卵管炎、输卵管堵塞为特征，往往导致产蛋高峰期的鸡产蛋量及产蛋质量迅速下降，特别是当年生的高产母鸡更多见。通常认为传染性支气管炎病毒、鸭源鸡杆菌(G.anatis)、减蛋综合征病毒及衣原体等是引起输卵管炎及输卵管囊肿主要病原体，尤其是G.anatis。RTX毒素(Repeatsintoxin)存在于多种革兰氏阴性菌中，在对特异性物种的致病过程中起重要作用，GtxA蛋白是鸭源鸡杆菌RTX样毒素，具有白细胞毒性和溶血活性，研究表明GtxA蛋白的N端区域具有良好的免疫原性，并证明重组蛋白GtxA-N可以引发有效的免疫保护可作为防制G.anatis的疫苗抗原。F17样菌毛是G.anatis的重要毒力因子，且可以作为非血清型依赖的保守的潜在疫苗候选蛋白。IBV病毒主要侵害鸡呼吸系统及消化生殖系统，并且有人认为鸡输卵管囊肿的发生与鸡IBV病毒早期感染有关，同时，G.anatis感染的鸡体内往往能分离出IBV病毒、减蛋综合征病毒和支原体等，因此，IBV病毒也是引起蛋鸡输卵管囊肿的重要病原。IBV病毒基因组共编码4种结构蛋白，其中病毒外膜上的纤突(S)蛋白在翻译后需裂解为S1和S2的2个蛋白亚基才能成为有生物学活性的成熟蛋白，Sl蛋白是IBV病毒的主要抗原。目前，G.anatis和IBV已呈全球性分布，且研究显示二者感染蛋鸡后均会引起输卵管炎和输卵管囊肿，因此，对这两种病的综合防控能在很大程度上减少蛋鸡输卵管囊肿和输卵管炎的发生，有效降低蛋鸡业的经济损失。疫苗免疫是防控疫病的重要手段，研制安全、高效、实用的G.anatis和IBV联合疫苗显得有为重要。疫苗的选择在整个免疫保护过程中非常重要，经黏膜侵入宿主是感染的重要的途径，因此通过黏膜免疫可以有效地抵制病原体的侵入。为此，需要研制一种可刺激机体黏膜免疫系统产生局部特异性免疫应答，从而引起全身性免疫反应的疫苗，由此对家禽进行免疫保护。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可制备安全、高效、实用的G.anatis和IBV联合疫苗的多基因重组干酪乳酸杆菌。本专利技术提供的一种多基因重组干酪乳酸杆菌，由重组质粒pMG36e-S1-GtxA-flfA电转化至干酪乳酸感受态细胞杆菌获得；所述多基因重组干酪乳酸杆菌由重组质粒pMG36e-S1-GtxA-flfA电转化至干酪乳酸感受态细胞杆菌获得；所述重组质粒pMG36e-S1-GtxA-flfA是将融合基因S1-GtxA-flfA连入线型质粒pMG36e的kPnI位点和SalI位点之间得到的，所述融合基因S1-GtxA-flfA的核苷酸序列如SEQIDNO.19所示。进一步的，所述干酪乳酸杆菌为Lb.caseiCECT5276。本专利技术还提供了上述多基因重组干酪乳酸杆菌的制备方法，包括如下步骤：S1，以IBVJin-13病毒cDNA为模板，设计特异性扩增引物1，上、下游引物如序列表SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，进行PCR扩增得IBV病毒S1基因片段；扩增片段经胶回收后与pMD18-T载体进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，并进行阳性克隆筛选和重组阳性质粒的鉴定，得到重组质粒pMD18-T-S1；以G.anatisUMN179全基因组为模板，设计特异性扩增引物2，上、下游引物如序列表SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示，进行PCR扩增得G.anatisGtxA基因片段；扩增片段经胶回收后与pMD18-T载体进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，并进行阳性克隆筛选和重组阳性质粒的鉴定，得到重组质粒pMD18-T-GtxA；以G.anatis全基因组为模板，设计特异性扩增引物3，上、下游引物如序列表SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示，进行PCR扩增得G.anatisflfA基因片段，扩增片段经胶回收后与pMD18-T载体进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，并进行阳性克隆筛选和重组阳性质粒的鉴定，得到重组质粒pMD18-T-flfA。S2，以重组质粒pMD18-T-S1模板，设计特异性扩增引物4，上、下游引物如序列表SEQIDNO：7和SEQIDNO：8所示，进行PCR扩增，经鉴定结果正确后进行胶回收，得到目的片段1；以重组质粒pMD18-T-GtxA模板，设计特异性扩增引物5，上、下游引物如序列表SEQIDNO：9和SEQIDNO：10所示，进行PCR扩增，经鉴定，结果正确后进行胶回收，得到目的片段2；以重组质粒pMD18-T-flf模板，设计特异性扩增引物6，上、下游引物如序列表SEQIDNO：11和SEQIDNO：12所示，进行PCR扩增，经鉴定结果正确后进行胶回收，得到目的片段3；S3，将目的片段1、目的片段2和目的片段3通过重叠PCR方法将其进行一次扩增，一次扩增结束后向PCR体系中加入特异性扩增引物7，上、下游引物如序列表SEQIDNO：13和SEQIDNO：14所示，进行二次扩增，将鉴定正确的扩增产物回收，得到融合基因S1-GtxA-flfA；S4，以pMG36e质粒为模板，设计特异性扩增引物8，上、下游引物如序列表SEQIDNO：15和SEQIDNO：16所示，进行PCR扩增，获得线性质粒pMG36e；S5，通过无缝克隆技术将融合基因S1-GtxA-flfA与线性质粒pMG36e进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌XL1-Bule感受态细胞，得到重组质粒pMG36e-S1-GtxA-flfA；S6，将重组质粒pMG36e-S1-GtxA-flfA与干酪乳酸杆菌感受态细胞混合，冰浴5min，然后高压脉冲电击转化，得多基因重组干酪乳酸杆菌。进一步的，上述多基因重组干酪乳酸杆菌的制备方法，S1中，PCR体系为：2×EasyTaqSuperPCRMasterMix25ul，上游引物1ul，下游引物1ul，模板DNA21ul；PCR程序为：95℃，5min；30个循环：95℃，30s，56℃，30s，72℃，引物1扩增60s/引物2扩增90s/引物3扩增30s；72℃,10min。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：本专利技术成功构建一株共表达IBV-S1及鸭源鸡杆菌FlfA、gtxA重组干酪乳酸杆菌，结合鸭源鸡杆菌是一种黏膜微生物，主要定植于上呼吸道、消化道及泌尿生殖系统这一特点，在制备针对共表达S1-GtxA-FlfA蛋白的活载体疫苗时选择乳酸菌作为递呈抗原的载体，这样不仅安全无毒，而且可以诱导机体肠道黏膜产生免疫应答，有刺激机体产生全身特异性免疫应答，从而起到保护作用。附图说明图1为本专利技术实施例1三种基因的PCR扩增结果图(M:DNAMarker250Ladder；1:IBVS1基因的PCR产物；2:G.anatisGtxA基因PCR产物；3：G.anatisflfA基因PCR产物)。图2为本专利技术实施例1重组质粒pMD18-T-S1的PCR鉴定(M:DNAMarker250Ladder；1:IBVS1基因的PCR产物；2:质粒pMD18-T-S1)。图3为本专利技术实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多基因重组干酪乳酸杆菌，其特征在于，所述多基因重组干酪乳酸杆菌由重组质粒pMG36e‑S1‑GtxA‑flfA电转化至干酪乳酸感受态细胞杆菌获得；所述重组质粒pMG36e‑S1‑GtxA‑flfA是将融合基因S1‑GtxA‑flfA连入线型质粒pMG36e的kPnI位点和SalI位点之间得到的，所述融合基因S1‑GtxA‑flfA的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。

【技术特征摘要】
1.一种多基因重组干酪乳酸杆菌，其特征在于，所述多基因重组干酪乳酸杆菌由重组质粒pMG36e-S1-GtxA-flfA电转化至干酪乳酸感受态细胞杆菌获得；所述重组质粒pMG36e-S1-GtxA-flfA是将融合基因S1-GtxA-flfA连入线型质粒pMG36e的kPnI位点和SalI位点之间得到的，所述融合基因S1-GtxA-flfA的核苷酸序列如SEQIDNO.19所示。2.如权利要求1所述的一种多基因重组干酪乳酸杆菌，其特征在于，所述干酪乳酸杆菌为Lb.caseiCECT5276。3.如权利要求1所述的多基因重组干酪乳酸杆菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，以IBVJin-13病毒cDNA为模板，设计特异性扩增引物1，上、下游引物如序列表SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，进行PCR扩增得IBV病毒S1基因片段；扩增片段经胶回收后与pMD18-T载体进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到重组质粒pMD18-T-S1；以G.anatis全基因组为模板，设计特异性扩增引物2，上、下游引物如序列表SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示，进行PCR扩增得G.anatisGtxA基因片段；扩增片段经胶回收后与pMD18-T载体进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到重组质粒pMD18-T-GtxA；以G.anatis全基因组为模板，设计特异性扩增引物3，上、下游引物如序列表SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示，进行PCR扩增得G.anatisflfA基因片段，扩增片段经胶回收后与pMD18-T载体进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到重组质粒pMD18-T-flfA。S2，以重组质粒pMD18-T-S1模板，设计特异性扩增引物4，上、下游引物如序列表SEQIDNO：7和SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨霞，常洪涛，王新卫，刘红英，李永涛，赵军，陈陆，王坤芃，王川庆，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41