一种低尿酸分泌量益生菌及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种通过基因工程方法制备的低尿酸分泌量益生菌及其制备方法，利用本发明专利技术方法可制备获得尿酸分泌量明显降低的改良益生菌，保留益生菌原有功效的同时，改善益生菌引起血液尿酸水平升高的不利影响。本发明专利技术还公开了一种可显著降低尿酸分泌量的干酪乳酸杆菌及一种降低尿酸产量的口服微生物制剂及其应用，通过口服含有高表达重组尿酸酶的益生菌来降低血尿酸的方法，可为痛风病人、高血尿酸症患者以及潜在高血尿酸人群提供更好的福利。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，更具体地讲，涉及一种通过基因工程方法制备低尿酸分泌量的益生菌制备方法及其应用。
技术介绍
人类胃肠道是IO14个细菌类生物的栖息地，这些栖息菌被称为共栖微生物 (commensal microbiota)。它们在婴儿出生后的最初几天即来到并建立起一种对宿主正常机能必需的重要共生关系。目前已知,人体共栖微生物种类达500余种，其中99. 9%是以双歧杆菌和类杆菌为主的专性厌氧菌，O. 1%是以肠杆菌科细菌为主的兼性厌氧菌。在成年个体中，这些微生物的总重量约1271克，相当于肝脏的重量。共栖微生物与人体的这种终生关系在人体抵抗病原体、营养吸收与代谢中起着重要作用。1989年，Fuller把这些对宿主起有益作用的活的微生物称为益生菌(Probiotics)。目前对益生菌的研究表明，益生菌对机体的主要有益作用包括I.代谢底物的消化(Digestion of metabolizable substrates)分解食物来源的膳食纤维、淀粉、低聚糖、糖、脂肪和蛋白质。以及人体来源的内源性粘蛋白，脱落的上皮细胞和肠组织，细菌碎片，胆汁酸和胆固醇。对这些人体不吸收的底物分解后主要形成短链脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs),例如醋酸、丙酸和丁酸。 SCFAs可以刺激盐和水的吸收、提供能量、维持肠道上皮细胞层的完整性等功能。2.定植抗力(Colonization resistance)肠道菌群，以黏附、嵌合等方式，形成膜样结构，通过其定植抗力，阻止致病菌黏附到上皮细胞；益生菌在胃肠道内能产生有机酸、游离脂肪酸、过氧化氢和细菌素等具有不同程度抗菌活性的物质。3.制造维生素(Production of vitamins)包括制造维生素B5、B6、B12、K2、生物素、核黄素、烟酸和硫胺素等，以及将有些维生素加工成人体可吸收利用的形式。4.形成粘附位点(Development of attachment sites)益生菌能够刺激肠道上皮细胞合成糖复合物，这些复合物被认为是益生菌附着的受体。5.诱导免疫系统发育(Induces development of the immune system)肠道正常菌群能够刺激肠道相关淋巴系统(gut-associated lymphoid system, GALT)的成熟。肠道菌群给GALT细胞提供了一系列的刺激性抗原，影响了局部和全身的淋巴细胞水平。6.生产外源性酶类(Production of exogenous enzymes)7.刺激肠道传输(Stimulation of intestinal transit)已证明，肠道菌群能够刺激肠蠕动，并参与了肠神经系统。肠道菌群影响行为与中枢神经系统功能的证据越来越多。肠道菌群也影响能量平衡，并且不断涌现的证据证明肠道菌群在肥胖的病理生理学中具有重要作用。8.肠细胞的成熟和更新(Maturation and turn-over of intestinal cells) 肠道菌群能够刺肠道上皮细胞的成熟和更新。正是因为肠内菌群的上述重要功能，目前国内开发了众多益生菌制剂用以改善个体的健康状况，效果明显。目前世界上研究的功能最强大的产品主要是以上各类微生物组成的复合活性益生菌，包括①乳杆菌类(如嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、詹氏乳杆菌、拉曼乳杆菌等);②双歧杆菌类(如长双歧杆菌、短双歧杆菌、卵形双歧杆菌、嗜热双歧杆菌等);③革兰氏阳性球菌(如粪链球菌、乳球菌、中介链球菌等)。此外，还有一些酵母菌。尽管益生菌对机体有必需的重要功能，但是作为活的生命体，益生菌也存在正常的繁殖和死亡的过程，并可产生诸多次级代谢产物。这其中，益生菌对机体尿酸水平的影响是需要考虑的重要问题之一，益生菌自身也具有分泌尿酸的能力，同时死亡菌体富含嘌呤， 嘌呤被机体吸收后最终会代谢成尿酸。两方面累计无疑会增加机体尿酸代谢的负担。尽管人体内尿酸是一种天然的抗氧化物质，具有提高抗氧化活性、防止身体出现氧化应激的作用。但是，因为尿酸的溶解度低，所以当人体内的嘌呤代谢发生紊乱或食入过量尿酸后，引发血尿酸浓度过高时，尿酸会以钠盐的形式沉积在关节、软骨和肾脏中， 引起组织异物炎性反应进而引起高尿酸血症和痛风。在我国，人体血液中尿酸含量男性 >416. 5 μ mol/L,女性>357 μ mol/L被定义为高尿酸血症。目前，在我国高尿酸血症已经发病率较高且呈快速上升现状。调查发现高尿酸血症的发病率已经相当普遍。据青岛大学医学院附属医院健康体检中心的公开统计资料显示，在1875例60 89岁老人中高血尿酸检出率达到了 23. 7%(青岛大学医学院学报，2012，47 (6) 520-522 )。江苏省省级机关医院社区体检中心公开资料显示，在年龄为48±15岁的5960例中青年中，高尿酸血症者患病率为10. 54%;在> 60岁的7860例老年人种，尿酸血症者患病率为13. 63% (实用老年医学，2011，25 (6) 454-456)0 广东省佛山市第一人民医院预防保健科体检中心统计结果发现，高尿酸血症是排在第4位的多发病，在1566名公安系统体检者中的发病率高达21. 78% (实用心脑肺血管病杂志， 2011，19(12)2195-2196)。上海市浦东新区北蔡社区卫生服务中心统计分析表明，在7516 位60岁以上的体检者中，高尿酸血症患者数占了 19. 50%，且无男女差别(实用心脑肺血管病杂志，2010，18 (11) 1597-1598)。根据国内外文献资料，人体内的尿酸来源有两种一种是体内经由黄嘌呤分解代谢产生的，约占80% ;另一种是从食物中获取的，约占20%。体内尿酸大部分经由肾脏排泄， 25%经消化道排泄(实用医学杂志，2004，20(3) :337-338)。目前用于降低严重高尿酸血症和急性痛风病人血液中尿酸含量的治疗药物主要是通过(I)抑制肾小管对尿酸的重吸收 (如丙磺舒和苯澳香豆酮等)，或(2)通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性来阻止尿酸的生成(如别嘌呤醇)，或(3)通过静注尿酸氧化酶直接将尿酸氧化成比较容易排泄的尿囊素等三种方式。但此三种方式均有一定不良反应，如丙磺舒等排尿酸药物能引起尿酸盐晶体在尿路的沉积，引发肾绞痛和肾功能损害；别嘌呤醇则具有致敏性，对骨髓有抑制作用，还具有胃肠道刺激、皮疹、发热、肝损害等不良反应；尿酸氧化酶是异源蛋白，可引发机体免疫反应，出现发热，恶心，呕吐和皮疹等不良反应，不能够长期多次用药。这些方式不适合用于改善普通高尿酸血症群体使用。根据人体尿酸25%来源于肠道吸收，且有25%的尿酸经消化系统排泄的原理，有文献报道利用蒙脱石(J Pharm Pharmacol. 2009 61 (11) : 1499-504)和活性炭(中国现代医学杂志，2003 ,13(22): 117-118)灌胃的方式，利用吸附剂吸附消化道内的尿酸可使高尿酸血症小鼠体内的尿酸水平得到显著降低。但吸附剂的主要不良反应是久服引起便秘，吸附的特异性较差，对营养物质也有吸附作用等。有必要寻找一种安全可靠，可用于预防和早期降低血液尿酸水平的新措施。人体内的益生菌是人体的共栖菌，可长期驻留在肠本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种低尿酸分泌量益生菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法包含如下步骤(1)构建包含有尿酸酶基因开放阅读框的重组质粒；(2)将(I)中所获得的重组质粒转染益生菌，筛选获得携带有该质粒的重组菌株；(3)在(2)中所获得的重组菌株中筛选获得重组质粒可稳定存在、尿酸酶可持续表达并具有明显尿酸分解活性的低尿酸分泌的菌株。2.根据权利要求I所述的一种低尿酸分泌量益生菌的制备方法，其特征在于，所述尿酸酶基因来自动物、植物、微生物的天然基因组序列或cDNA序列，或根据受体菌的密码子偏向性人工优化设计合成的序列。3.根据权利要求2所述的一种低尿酸分泌量益生菌的制备方法，其特征在于，所述尿酸酶基因来自动物的天然基因组序列或cDNA序列，或根据受体菌的密码子偏向性人工优化设计合成的序列。4.根据权利要求3所述的一种低尿酸分泌量益生菌的制备方法，其特征在于，所述尿酸酶基因来自猪的天然基因组序列或cDNA序列，或根据受体菌的密...

【专利技术属性】
技术研发人员：章泽人，刘思国，
申请(专利权)人：章泽人，刘思国，
类型：发明
国别省市：