用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法，包括：制备含有T7终止子、P基因、L基因、NP基因和IRES片段的三种辅助质粒，和含有T7启动子、锤头状酶序列、乙肝核酶序列、T7终止子的pUC57‑Simple质粒；将所述pUC57‑Simple质粒酶切后连接full‑2质粒酶切产物，得到仙台病毒主骨架质粒；提供BSR‑T7/5细胞，使用DMEM无血清完全培养基培养；转染前换液为Opti‑MEM培养基，并加入所述病毒辅助质粒T7‑IRES‑P/L/NP和所述仙台病毒主骨架质粒；在lipo3000中添加聚乙烯亚胺作为转染试剂进行转染；将转染后的细胞体进行增殖培养，收集重组仙台病毒。

Preparation and application of recombinant Sendai virus for reprogramming human cells

【技术实现步骤摘要】
用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法及其应用
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法及其应用。
技术介绍
仙台病毒(SeV)，也称为1型副流感病毒或HVJ(HemagglutinatingVirusofJapan，日本血凝病毒)，是副粘病毒科的一种负链单股单链RNA病毒。仙台病毒具有以下几个特征，使得仙台病毒载体在导入外源基因过程中具有很强的优势：(1).仙台病毒的生命周期中，病毒蛋白和基因组均在细胞质内，病毒基因组不与细胞基因组进行整合；(2).仙台病毒能够在细胞全生命周期内进行感染，能够以极高的效率感染大多数细胞，包括慢病毒难以感染的细胞类型；3.表达外源基因高效并且可调控，在体内和体外实验中均可以检测到高表达的目的基因。因此，仙台病毒作为一种高效的基因转导工具被广泛研究。自从山中伸弥(ShinyaYamanaka)和高桥和利(KazutoshiTakahashi)在2006年8月报道了将小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)细胞重编程为诱导性多能干(iPS)细胞之后，大量实验室尝试利用体细胞重编程为iPS细胞，并取得了许多重要进展。目前，科学家们已经开发了数种方法用于细胞重编程诱导产生iPS细胞，包括慢病毒诱导。然而，这种方法诱导产生iPS细胞，需要进行多次感染，流程繁琐，重编程效率低；且慢病毒包装时效率低、病毒基因组整合目的细胞基因组，造成插入突变和残留表达，干扰诱导效果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法，旨在解决现有细胞重编程诱导产生iPS细胞的方法，重编程效率低，病毒基因组整合，且包装病毒纯度中容易引入其他活性病毒的问题。本专利技术的另一目的在于提供一种采用上述方法制备的重组仙台病毒将人体皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞的方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术一方面提供一种用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法，包括以下步骤：提供pBluescriptIISK(+)质粒和T7终止子，采用infusion融合技术制备pBluescriptIISK(+)T7terminator质粒；将所述pBluescriptIISK(+)T7terminator质粒采用Kpn1和Not1酶切处理后，分别插入P基因、L基因和NP基因，获得T7-P/L/NP质粒；将所述T7-P/L/NP质粒采用Kpn1酶切成线性质粒后，与IRES片段进行融合，制备病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP；在pUC57质粒中插入T7终止子、T7启动子、锤头状酶序列、乙肝核酶序列，制备pUC57-Simple质粒；将所述pUC57-Simple质粒采用Kpn1、Not1酶切，同时连接经Kpn1、Not1酶切后的full-2质粒酶切产物，制备得到pUC57-Sev，将所述pUC57-Sev与目的基因连接，得到仙台病毒主骨架质粒；提供BSR-T7/5细胞，接种、培养；转染前将培养基换液为Opti-MEM培养基，然后加入所述病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP和所述仙台病毒主骨架质粒继续培养；在lipo3000中添加聚乙烯亚胺作为转染试剂，按照lipo3000说明书进行转染；将转染后的细胞体系置于病毒增殖培养基中进行增殖培养，经沉淀处理收集重组仙台病毒，其中，所述病毒增殖培养基含有TPCK处理胰酶或重组人肺β类胰蛋白酶、以及谷氨酰胺。本专利技术的另一方面提供一种将人体皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞的方法，包括以下步骤：提供上述方法制备得到的重组仙台病毒；接种人体皮肤成纤维细胞，培养至50％～70％汇合度时，在人体皮肤成纤维细胞中加入所述重组仙台病毒溶液，继续培养，感染后换新鲜HDF培养基继续培养，收集iPS细胞，所述重组仙台病毒溶液为Sev-Klf4-Oct4-Sox2重组仙台病毒和Sev-Myc重组仙台病毒的混合物。本专利技术提供的用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法，具有以下优点：首先，构建含有T7终止子、P基因、L基因、NP基因和IRES片段的3个病毒包装辅助质粒和含有T7启动子、锤头状酶序列、乙肝核酶序列和T7终止子的仙台病毒主骨架质粒，两者结合形成不依赖辅助包装病毒(通常的辅助病毒为vTF7.3或MVA-T7，两者都是包含完整T7聚合酶序列的重组痘病毒)的纯质粒仙台病毒包装系统。由此形成的纯质粒包装系统，不会引入其他活性病毒，如vTF7.3或MVA-T7工程学病毒，从而可以保证重组仙台病毒的纯度，同时避免了后续杂病毒的污染，提升了病毒包装过程中的安全性，进而在采用重组仙台病毒诱导人体细胞重编程为iPS细胞时，提高诱导效果。其次，采用P基因、L基因、NP基因对应的三种病毒辅助质粒，P基因、L基因、NP基因聚合在一起形成RNA聚合酶复合体，促进仙台病毒的包装，有利于提高包装效率；而IRES(internalribosomeentrysite内部核糖体进入位点)片段，可以不依赖mRNA的帽子结构进入核糖体进行蛋白翻译(通常别的仙台病毒或负黏病毒科病毒包装依赖辅助病毒，辅助病毒有加帽活性，但是依赖加帽活性的包装效率很低)，可以促进T7聚合酶生成的mRNA进一步表达成蛋白的效率，进而提升病毒包装效率。所述仙台病毒主骨架质粒中同时含有T7终止子、T7启动子、锤头状酶序列、乙肝核酶序列，其中，在病毒基因组起始位置之前插入一段优化的锤头状核酶序列，可以使仙台病毒的Leader序列的起始位点处断裂，配合病毒基因组终止位置加入的乙肝核酶序列(促使仙台病毒的Trailer序列的最后一个碱基处断裂)，从而获得完整的仙台病毒基因组RNA，显著提升仙台病毒的包装效率。再次，本专利技术在仙台病毒包装体系的转染过程中，以BSR-T7/5细胞作为病毒包装细胞系，提高了转染效果和病毒包装生产滴度；同时采用添加聚乙烯亚胺的lipo3000作为转染试剂，所述聚乙烯亚胺通过与DNA结合形成阳离子聚合物介导的内吞作用，竞争性弥补lipo3000通过脂质体介导的内吞作用的不足，从而提高转染效率。本专利技术提供的将人体皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞的方法，通过构建多顺反子的仙台病毒用于人体皮肤成纤维重编程，可将KLF4、c-MYC、OCT4和SOX2基因导入人体成纤维细胞，诱导生成iPS细胞。本专利技术提供的采用重组仙台病毒将人体皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞的方法，与相同滴度慢病毒相比，其效率提高5倍左右，且诱导获得的iPS细胞能够在体外传代，稳定表达干细胞相关基因同时长期维持干性，解决了慢病毒病毒效率低，重编程困难的问题。附图说明图1是本专利技术实施例提供的锤头状酶序列模式图；图2是本专利技术实施例提供的乙肝核酶模式图；图3是本专利技术实施例提供的仙台病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP酶切片段电泳结果图；图4是本专利技术实施例提供的仙台病毒主骨架质粒pUC57-Sev-GFP酶切片段电泳结果图；图5是本专利技术实施例提供的采用lipo3000和lipo3000+PEI法，将pUC57-Sev-GFP质粒转染进BSR-T7/5细胞后的荧光效果图；图6是本专利技术实施例提供的BSR-T7/5细胞包装GFP仙台病毒的包装效率比较图；图7是本专利技术实施例提供的商品化慢病毒S和重组仙台病本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：提供pBluescript II SK(+)质粒和T7终止子，采用infusion融合技术制备pBluescript II SK(+)T7 terminator质粒；将所述pBluescript II SK(+)T7 terminator质粒采用Kpn1和Not1酶切处理后，分别插入P基因、L基因和NP基因，获得T7‑P/L/NP质粒；将所述T7‑P/L/NP质粒采用Kpn1酶切成线性质粒后，与IRES片段进行融合，制备病毒辅助质粒T7‑IRES‑P/L/NP；在pUC57质粒中插入T7终止子、T7启动子、锤头状酶序列、乙肝核酶序列，制备pUC57‑Simple质粒；将所述pUC57‑Simple质粒采用Kpn1、Not1酶切，同时连接经Kpn1、Not1酶切后的full‑2质粒酶切产物，制备得到pUC57‑Sev，将所述pUC57‑Sev与目的基因连接，得到仙台病毒主骨架质粒；提供BSR‑T7/5细胞，接种、培养；转染前将培养基换液为Opti‑MEM培养基，然后加入所述病毒辅助质粒T7‑IRES‑P/L/NP和所述仙台病毒主骨架质粒继续培养；在lipo3000中添加聚乙烯亚胺作为转染试剂，按照lipo3000说明书进行转染；将转染后的细胞体系置于病毒增殖培养基中进行增殖培养，经沉淀处理收集重组仙台病毒，其中，所述病毒增殖培养基含有TPCK处理胰酶或重组人肺β类胰蛋白酶、以及谷氨酰胺。...

【技术特征摘要】
1.一种用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：提供pBluescriptIISK(+)质粒和T7终止子，采用infusion融合技术制备pBluescriptIISK(+)T7terminator质粒；将所述pBluescriptIISK(+)T7terminator质粒采用Kpn1和Not1酶切处理后，分别插入P基因、L基因和NP基因，获得T7-P/L/NP质粒；将所述T7-P/L/NP质粒采用Kpn1酶切成线性质粒后，与IRES片段进行融合，制备病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP；在pUC57质粒中插入T7终止子、T7启动子、锤头状酶序列、乙肝核酶序列，制备pUC57-Simple质粒；将所述pUC57-Simple质粒采用Kpn1、Not1酶切，同时连接经Kpn1、Not1酶切后的full-2质粒酶切产物，制备得到pUC57-Sev，将所述pUC57-Sev与目的基因连接，得到仙台病毒主骨架质粒；提供BSR-T7/5细胞，接种、培养；转染前将培养基换液为Opti-MEM培养基，然后加入所述病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP和所述仙台病毒主骨架质粒继续培养；在lipo3000中添加聚乙烯亚胺作为转染试剂，按照lipo3000说明书进行转染；将转染后的细胞体系置于病毒增殖培养基中进行增殖培养，经沉淀处理收集重组仙台病毒，其中，所述病毒增殖培养基含有TPCK处理胰酶或重组人肺β类胰蛋白酶、以及谷氨酰胺。2.如权利要求1所述的用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法，其特征在于，所述病毒辅助质粒T7-IRES-P/L/NP中，所述IRES片段添加在T7启动子后，所述T7终止子添加在T3启动子之前。3.如权利要求2所述的用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法，其特征在于，所述pBluescriptIISK(+)质粒采用第一引物组扩增获得，所述pBluescriptIISK(+)质粒的片段长度2961bp，所述第一引物组包括：第一上游引物：CAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGG第一下游引物：GAGCTCCACCGCGGTGGC；所述T7终止子采用第二引物组、以pET-28a(+)作为模板扩增获得，所述T7终止子的片段长度为159bp，所述第二引物组包括：第二上游引物：ACCGCGGTGGAGCTCctgctaacaaagcccgaaagg第二下游引物：AGGGAACAAAAGCTGatccggatatagttcctcc；所述IRES片段采用第三引物组、以pH2B_mCherry_IRES_puro2作为模板扩增获得，所述第三引物组包括：第三上游引物：CTATAGGGCGAATTGGGTACCatgcatctagggcggccaattc第三下游引物：TTGATCCATGGTGGCGGTACCagcttatcatcgtgtttttcaaaggaaaaccacgtc。4.如权利要求3所述的用于人体细胞重编程的重组仙台病毒的制备方法，其特征在于，所述采用infusion融合技术制备pBluescriptIISK(+)T7terminator质粒的步骤中，依照VAZYMEC115-ClonExpressUltraOneStepCloningKit试剂盒的操作进行infusion融合，制备pBluescriptIISK(+)T7terminator质粒；所述将所述T7-P/L/NP质粒采用...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：深圳市瑞亚再生医学科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：广东,44