一种高产脂肽的重组菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了属于基因工程技术领域的一种高产脂肽的重组菌及其应用，所述高产脂肽的重组菌，其是将亮氨酸合成途径中的2‑异丙基苹果酸合酶基因转化至原始菌株构建而成。本发明专利技术的进一步过表达部分亮氨酸合成路径(2‑异丙基苹果酸合酶、3‑异丙基苹果酸脱氢酶、3‑异丙基苹果酸脱水酶和支链氨基酸转氨酶)的重组菌与出发菌株相比，表面活性素产量最高提高了55.6％，可用于脂肽类生物表面活性剂的生产，具有良好的工业应用前景，摇瓶发酵所得发酵液中脂肽产量平均为13‑16g/L。

A recombinant bacterium with high production of lipopeptide and its application

【技术实现步骤摘要】
一种高产脂肽的重组菌及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种高产脂肽的重组菌及其应用。
技术介绍
脂肽(lipopeptide)类生物表面活性剂是一类由亲水的环状寡肽与疏水的脂肪酸链以内酯键连接而成的两性物质，主要由芽孢杆菌、链霉菌等微生物合成。由于组成脂肽的肽环中氨基酸组成与成环方式不同，芽孢杆菌脂肽可分为表面活性素、芬芥素、伊枯草菌素等，其中在气/液界面形成独特“马鞍”构象的表面活性素具有良好的表面活性、生物降解性及抗菌活性，在石油开采、生物防治、医药及日化等领域都有广阔的应用前景。但由于芽孢杆菌发酵生产表面活性素产率低限制了表面活性素的工业化生产和应用。目前，提高微生物脂肽发酵水平的方法包括培养条件优化、诱变育种、强化表面活性素跨膜运输、强化表面活性素合成酶表达、强化脂肪酸前体供应等。专利文献(CN101892176A、CN101775427A、WO2002026961A)等通过对枯草芽孢杆菌发酵生产表面活性素发酵过程中培养基及培养条件进行优化，提高了发酵液中表面活性素的产量。诱变育种方面，CN101928677A公开了通过紫外诱变处理玫瑰孢链霉菌，US05227294公开了用亚硝基甲替尿烷处理枯草芽孢杆菌，上述文献中的微生物在诱变处理后，其表面活性素合成量都有增加。基因工程改造方面，中国专利文献CN103898038A公开了通过强化脂肽由胞内向胞外运输的跨膜蛋白YcxA，枯草芽孢杆菌发酵生产的表面活性素产量提高了97％。中国专利文献CN1554747A公开了在枯草芽孢杆菌中表达comA基因，脂肽产量提高了50％。另外，枯草芽孢杆菌中脂肪酸和氨基酸在表面活性素合成酶的作用下催化合成表面活性素，中国专利文献CN105400784A通过将脂肽合成酶基因簇启动子替换成诱导型强启动子Pg3，表面活性素产量提高了17.7倍。中国专利文献CN109097315A通过过表达支链脂肪酸合成途径中生物素羧化酶YngH，表面活性素产量提高了47％。(QunWu,YanZhi,YanXu,SystematicallyengineeringthebiosynthesisofagreenbiosurfactantsurfactinbyBacillussubtilis168[J].MetabolicEngineering,2019,52:87-97)公开了强化细胞内支链脂肪酸合成整条路径提高前体脂肪酸的供应，从而表面活性素产量提高了20.8倍。关于表面活性素合成的另一类主要前体氨基酸，(CoutteF,NiehrenJ,DhaliD,etal.Modelingleucine'smetabolicpathwayandknockoutpredictionimprovingtheproductionofsurfactin,abiosurfactantfromBacillussubtilis[J].BiotechnologyJournal,2015,10(8SI):1216-1234)公开了培养基中添加亮氨酸可使表面活性素产量提高3倍，说明提高亮氨酸含量是提高表面活性素产量的有效策略。但是，(QunWu,YanZhi,YanXu,SystematicallyengineeringthebiosynthesisofagreenbiosurfactantsurfactinbyBacillussubtilis168[J].MetabolicEngineering,2019,52:87-97)在产表面活性素的宿主菌中过表达了亮氨酸合成途径中的乙酰乳酸合酶AlsS、酮醇酸还原异构酶IlvC、二羟基酸脱水酶IlvD、2-异丙基苹果酸合酶LeuA、3-异丙基苹果酸脱氢酶LeuB和3-异丙基苹果酸脱水酶LeuCD，表面活性素产量并没有提高。关于强化细胞中亮氨酸合成有效提高表面活性素产量的研究未见报道。
技术实现思路
为了克服现有技术中的缺点，本专利技术的目的在于提供一种高效的生产脂肽的重组菌，其可以提高脂肽的产量。所述重组菌，其是将亮氨酸合成途径中的2-异丙基苹果酸合酶基因转化至原始菌株构建而成。上述重组菌中，可选择的，所述重组菌还转入了3-异丙基苹果酸脱氢酶基因、3-异丙基苹果酸脱水酶基因和支链氨基酸转氨酶基因中的一个或一个以上。上述重组菌中，所述3-异丙基苹果酸脱氢酶、3-异丙基苹果酸脱水酶和支链氨基酸转氨酶生物素羧化酶分别为LeuB、LeuCD和IlvK蛋白或其具有相同功能的突变体，上述重组菌中，优选的，所述LeuB蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，所述LeuC蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，所述LeuD蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，所述IlvK蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。上述重组菌中，所述2-异丙基苹果酸合酶为LeuA蛋白或其具有相同功能的突变体，优选的，所述LeuA蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。上述重组菌中，所述原始菌株为具有产脂肽能力的野生菌及其诱变株、突变株或基因工程改造株。上述重组菌中，所述原始菌株为枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或假单胞菌。上述重组菌中，可选择的，所述原始菌株为枯草芽孢杆菌BacillussubtilisTHY-7。所述枯草芽孢杆菌BacillussubtilisTHY-7，于2014年3月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCCNo.8906，并在中国专利文献CN105400784A中公开。上述重组菌中，可选择的，所述原始菌株为枯草芽孢杆菌BacillussubtilisTHY-7/Pg3-srfA。所述枯草芽孢杆菌BacillussubtilisTHY-7/Pg3-srfA，是指在枯草芽孢杆菌BacillussubtilisTHY-7中加入诱导型强启动子Pg3，使强启动子Pg3控制表面活性素合成酶srfA的表达。关于诱导型强启动子Pg3、枯草芽孢杆菌BacillussubtilisTHY-7/Pg3-srfA及其具体的制备方法在中国专利文献CN105400784A中有公开。上述重组菌中，所述LeuA、LeuB、LeuC和LeuD蛋白受强启动子控制，所述IlvK蛋白受原组成型启动子控制。本专利技术的目的还提供上述重组菌在生产脂肽中的应用。上述应用中，所述脂肽类生物表面活性剂为表面活性素。一种上述重组菌的制备方法，包括如下步骤：扩增得到2-异丙基苹果酸合酶、3-异丙基苹果酸脱氢酶、3-异丙基苹果酸脱水酶基因簇leuABCD和带有自身组成型启动子的支链氨基酸转氨酶生物素羧化酶IlvK，将LeuABCD和IlvK基因序列插入穿梭质粒，构建表达质粒；将表达质粒导入原始菌株，构建重组菌。进一步的，具体方法为：1、利用上下游引物，以枯草芽孢杆菌基因组为模板进行聚合酶链式反应，扩增并获得leuABCD基因，优选的，其核酸序列如SEQIDNO.6所示。同样的，扩增并获得ilvK基因，优选的，其核酸序列如SEQIDNO.7所示。2、将leuABCD和ilvK基因以及穿梭质粒分别进行双酶切，使用连接酶将两种酶切产物进行连接，得到连接产物。3、将连接产物转化大肠杆菌E.coliTOP10感受态细胞，进行抗性筛选阳性克隆，得到含有le本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高产脂肽的重组菌，其是将亮氨酸合成途径中的2‑异丙基苹果酸合酶基因转化至原始菌株构建而成。

【技术特征摘要】
1.一种高产脂肽的重组菌，其是将亮氨酸合成途径中的2-异丙基苹果酸合酶基因转化至原始菌株构建而成。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌还转入了3-异丙基苹果酸脱氢酶基因、3-异丙基苹果酸脱水酶基因和支链氨基酸转氨酶基因中的一个或一个以上。3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，所述3-异丙基苹果酸脱氢酶、3-异丙基苹果酸脱水酶和支链氨基酸转氨酶生物素羧化酶分别为LeuB、LeuCD和IlvK蛋白或其具有相同功能的突变体，优选的，所述LeuB蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，所述LeuC蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，所述LeuD蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，所述IlvK蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述2-异丙基苹果酸合酶为LeuA蛋白或...

【专利技术属性】
技术研发人员：于慧敏，王苗苗，许春梦，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11