本发明专利技术公开了一种高产苏氨酸的基因工程菌及其应用方法，属于基因工程和发酵工程领域。所述基因工程菌为TWF001/pFW01‑phaCAB，在三氯生表达质粒pFW01上过表达了phaCAB，可以在胞外合成苏氨酸，胞内合成PHB。本发明专利技术构建的菌株苏氨酸合成量大大提高，在摇瓶发酵水平产量为17.0g/L，在3‑L罐发酵水平，合成苏氨酸产量为96.4g/L，在10L罐发酵水平，合成苏氨酸产量为133.5g/L。所述基因工程菌为TWF001/pFW01‑phaCAB生长状况良好，未引入外源抗性基因序列，更有利于大规模工业化生产。
A Genetically Engineered Strain with High Threonine Production and Its Application
【技术实现步骤摘要】
一种高产苏氨酸的基因工程菌及其应用方法
本专利技术涉及一种高产苏氨酸的基因工程菌及其应用方法，属于基因工程和发酵工程领域。技术背景作为8种必需氨基酸之一，L-苏氨酸是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸。以添加了苏氨酸的低蛋白配方饲料作为家禽日粮，不但降低了饲喂成本，还有利于家禽吸收，可促进家禽的生长。除了可以缓解天然蛋白质的匮乏，家禽饲料营养配比合理还可以有效减少动物氨的排放，从而减少环境污染，有利于社会的可持续发展。此外，L-苏氨酸在食品、医药和化妆品等领域的用量也呈长期稳定增长趋势。在食品领域，L-苏氨酸是各类氨基酸保健饮品的配方成分，也是重要的食品强化剂，可以与其他氨基酸共用起到抗氧化的作用，还可以与葡萄糖共热产生焦香味。在医药领域，L-苏氨酸有促进人体生长发育、促进骨髓T淋巴细胞前体分化发育成为成熟T淋巴细胞和抗脂肪肝的药用疗效，因此在临床方面有着广泛的应用。此外，L-苏氨酸还是制造高效低过敏的抗生素单酰胺菌素等药物的中间体。在化妆品领域，L-苏氨酸的分子具有羟基结构，因此可用作保湿剂。苏氨酸的工业生产方法主要有蛋白水解、化学合成和微生物发酵。相对于前两种方法，发酵法优点是原料便宜、反应条件温和、环境污染小、效率高等。大肠杆菌由于其遗传背景清楚，基因操作简单，发酵周期短等优点，在工业生产饲料添加级苏氨酸中占主要地位。由于目前苏氨酸生产高产菌是大肠杆菌，大肠杆菌虽生长迅速发酵周期短，但是转化率也并不高。该工业化生产的出发菌株，目前利用葡萄糖生产苏氨酸经济效益最好，但是转化率低，摇瓶作为对照时，转化率为40％。
技术实现思路
本专利技术目的在于提高该菌株的产量和转化率，并建立一种在大肠杆菌里高产苏氨酸的方法，同时这种方法可以运用到不同的产品生产。本专利技术第一个目的是提供一株高产苏氨酸的基因工程菌，所述菌株以具有苏氨酸生产能力的菌株为出发菌株，过表达了来自罗氏真养菌基因组的phaCAB基因簇。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌TWF001为出发菌株，以质粒pFW01为表达质粒；所述TWF001和pFW01公开于2018年的论文《Increasingl-threonineproductioninEscherichiacolibyengineeringtheglyoxylateshuntandthel-threoninebiosynthesispathway》。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌是在大肠杆菌TWF001中，过表达了来自罗氏真养菌基因组的phaCAB基因簇，该基因簇如GenBank登录号MH558939.1所示核苷酸序列。在本专利技术的一种实施方法中，基因phaA、phaB和phaC分别编码的β-酮硫解酶，乙酰乙酰辅酶A还原酶和PHB合成酶，在大肠杆菌中可以以乙酰辅酶A为底物合成β-聚3-羟基丁酸酯(PHB)。本专利技术的第二个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，是将所述phaCAB基因簇与表达载体连接，在大肠杆菌宿主细胞中表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体为pFW01。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌TWF001。本专利技术的第三个目的是提供一种联产L-苏氨酸和β-聚3-羟基丁酸酯的方法，应用所述基因工程菌进行发酵。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵是将所述基因工程菌接种至发酵培养基中，35～37℃，180～220rpm发酵至少24h。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵过程控制溶氧为30％，pH6.8。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌经过两级种子培养。在本专利技术的一种实施方式中，第一级种子培养基为LB培养基，第二级种子培养基含有32.5g/L葡萄糖,5g/L(NH4)2SO4,15g/L酵母浸提物,9.5g/LKH2PO4,24.35g/LK2HPO4,1g/LMgSO4·7H2O,pH7.0。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵过程中还进行补料。在本专利技术的一种实施方式中，所述补料是当发酵体系残糖低于5g/L时则补加葡萄糖溶液至残糖达10g/L。本专利技术还要求保护所述基因工程菌在生产含L-苏氨酸和/或β-聚3-羟基丁酸酯及其衍生物方面的应用。本专利技术的效果：(1)本专利技术构建的一株高产苏氨酸的菌株E.coliTWF001/pFW01-phaCAB，遗传性能非常稳定，应用时无需添加抗生素，只需要添加终浓度为1μM的三氯生即可保证质粒稳定遗传，适合工业化生产。(2)在工业化生产苏氨酸的菌株里面，过表达了来自罗氏真养菌基因组的phaCAB基因簇，通过联产β-聚3-羟基丁酸酯(PHB)的方法，能有效提高苏氨酸产量。应用本专利技术的方法构建的菌株TWF001/pFW01-phaCAB的苏氨酸产量在10-L发酵罐水平达到133.5g/L，与对照菌株TWF001/pFW01相比提高了41.6％，转化率对应也提高了31.6％；在3-L发酵罐水平达到96.4g/L，与对照菌株TWF001/pFW01相比提高了31.7％，转化率对应也提高了31.7％；在摇瓶发酵水平达到17.0g/L，与对照菌株TWF001/pFW01相比提高了74.9％，转化率对应也提高了72.7％；该方法核心思想是通过联产PHB，拉动胞内碳源代谢，增加乙酰辅酶A合成量，减少副产物乙酸的合成，增强细胞的代谢平衡，并通过乙醛酸循环快速利用乙酰辅酶A。(3)本专利技术的方法——通过偶联PHB和苏氨酸合成，能够有效提高苏氨酸产量，同时也适用于通过联产PHB的途径生产其他天冬氨酸族氨基酸，比如将苏氨酸合成基因改变为赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸等途径的基因生产相应氨基酸；附图说明图1：重组质粒pFW01-phaCAB示意图。图2：对照菌株TWF001/pFW01和基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB苏氨酸高产菌株的摇瓶发酵情况；其中，A为菌株生长，B为菌株发酵的耗糖情况，C为苏氨酸产量，D为发酵36h后的乙酸合成量。图3：对照菌株TWF001/pFW01和基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB苏氨酸高产菌株的摇瓶发酵合成PHB的情况；其中，A为TWF001/pFW01-phaCAB合成PHB颗粒的激光共聚焦观察照片，B为对照菌TWF001/pFW01的激光共聚焦观察照片，C为PHB合成量。图4：对照菌株TWF001/pFW01和基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB苏氨酸高产菌株的摇瓶发酵对数期合成乙酰辅酶A和苹果酸的情况。图5：对照菌株TWF001/pFW01和基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB苏氨酸高产菌株的发酵情况；其中，A为菌株生长情况，B为菌株耗糖情况，C为菌株发酵的苏氨酸产量。图6：对照菌株TWF001/pFW01和基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB苏氨酸高产菌株的10-L罐发酵情况；其中，A为菌株生长情况，B为菌株发酵的苏氨酸产量。具体实施方式实施例1重组菌TWF001/pFW01-phaCAB的构建(1)以罗氏真养菌基因组NC_008313.1为模板，采用引物phaCAB-F/phaCAB-R扩增phaCAB基因簇，扩增phaCAB基因簇的引物phaCAB-F/phaCAB-R序列为phaCAB-F：5’-CTGCTCGAGAGAA本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株基因工程菌，其特征在于，是过表达了来自罗氏真养菌的phaCAB基因簇的大肠杆菌，可联产L‑苏氨酸和β‑聚3‑羟基丁酸酯。
【技术特征摘要】
1.一株基因工程菌，其特征在于，是过表达了来自罗氏真养菌的phaCAB基因簇的大肠杆菌，可联产L-苏氨酸和β-聚3-羟基丁酸酯。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌TWF001为出发菌株。3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在大肠杆菌TWF001中，过表达了序列如GenBank登录号MH558939.1的phaCAB基因簇。4.一种构建权利要求1～3任一所述基因工程菌的方法，其特征在于，将所述phaCAB基因簇与表达载体连接，在大肠杆菌宿主细胞中表达。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将如GenBank登录号MH558939.1的phaCAB基因簇与表达载...
【专利技术属性】
技术研发人员：王小元，王建莉，马文渐，方宇，赵磊，董笑飞，詹依，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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