一种降解蛋白质的产朊假丝酵母单基因表达菌株及其构建方法技术

本发明专利技术涉及遗传工程和发酵工程领域，具体公开了一种降解蛋白质的产朊假丝酵母单基因表达菌株，所述产朊假丝酵母单基因表达菌株为将羧肽酶基因通过产朊假丝酵母表达载体整合至产朊假丝酵母基因组上构建而成。本发明专利技术对餐厨发酵残液进行处理，将其中的有机物进一步利用，相对于现有技术来说，将餐厨发酵液中大量的蛋白质分解转变成氨基酸，不仅可以解决残存的蛋白质污染问题，还可以生产出氨基酸，氨基酸是制药、生物饲料、有机肥的原材料，具有一定的经济价值。

A Protein-degrading Monogenous Candida prion-producing Strain and Its Construction Method

【技术实现步骤摘要】
一种降解蛋白质的产朊假丝酵母单基因表达菌株及其构建方法
本专利技术涉及遗传工程和发酵工程领域，更具体地，涉及一种降解蛋白质的产朊假丝酵母单基因表达菌株及其构建方法。
技术介绍
餐厨垃圾俗称泔水，是居民在生活中形成的固体废弃物，食品浪费的数量正在随着人口的快速增加和经济的快速发展而迅速增长，残留的肉类，蔬菜，油脂，米饭是餐厨垃圾中的主要物质。在化学成分上，主要含有纤维素类，蛋白质类，糖类，脂肪类等有机物成分，具有含水量高，有机物比例高，含盐量高的特点。由于餐厨垃圾产量巨大，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌等多种有毒有害的病原微生物经常会在含有丰富的营养物质的餐厨垃圾中滋生。如果没有及时的加工处理，还会腐烂变质，产生NH3和H2S等大量带有臭味的气体和毒素等，不仅造成严重的空气问题，同时非法使用餐厨垃圾提取的废油已经对人的健康产生严重的危害。根据统计，在餐饮行业中每年就有大约有4亿吨餐厨垃圾，造成的浪费总价值高达7500亿美元，而且还在呈现不断增长的趋势。所有急需要找到一种切实有效的方法对餐厨垃圾进行综合利用，不合理的利用餐厨垃圾不仅会造成严重的资源的浪费，还会造成严重的环境污染。焚烧处理和用作饲料是对餐厨垃圾的传统的处理方法；焚烧不仅对餐厨垃圾的利用效率低下，而且会排出大量的二氧化碳，使全球气候变暖加剧，大量的含氮、含硫、二噁英等化合物的产生，不仅污染空气，也会对人的身体产生极大的危害。餐厨垃圾处理后做成饲料饲喂牲畜，饲料中含有大量的有毒有害微生物和难于降解的毒素，饲养牲畜后，不仅会容易造成牲畜致病，还会使毒素在牲畜体内富集，最终影响到人的健康，而且其中含有不同来源的大量生物蛋白，未经处理饲喂牲畜存在的潜在的生物安全风险，所有需要发展一种有效的方法，对餐厨垃圾进行综合的利用，既可以避免垃圾围城，保护环境，减数有害气体，温室气体的排出，也可以达到提升废物产品的利用价值，对资源达到综合的利用。微生物发酵正在被国内外业界重视，发酵技术正在成为一种对餐厨垃圾综合利用的有效方式，真正达到资源节约和环境有好地目的。发酵残液，一般是指在工业生产应用中，原材料经过微生物的发酵后所产生的废渣或废液的总称。而餐厨乙醇发酵残液，是指原始的餐厨垃圾经过了油脂去除，酵母菌酒精发酵以及酒精蒸馏提取等一系列工艺流程得到的微生物未利用的废弃物。经过前面工艺中的油脂去除和酒精发酵，餐厨垃圾中原有的油脂类和糖类化合物基本被利用完，而餐厨垃圾中的蛋白质类化合物只有很少的一部分被微生物生长所利用，大部分蛋白质以废弃物的形式残留在发酵残液中，而且随着工业上对餐厨垃圾发酵的进一步研究和发展，必然会使发酵产生的残液越来越多，如果不经过有效的处理，随意排放，残液中大量的蛋白质类有机物，不仅会造成有毒有害微生物的大量繁殖，而且会对环境造成严重的危害，所以必须采取有效的处理方式，对餐厨发酵残液进行处理，而处理的关键是将其中的有机物进一步利用，将大量的蛋白质分解转变成氨基酸就成为一条可行的办法，不仅可以解决残存的蛋白质污染问题，氨基酸还是制药、生物饲料、有机肥的原材料，具有一定的经济价值。
技术实现思路
本专利技术旨在克服上述现有技术的至少一种不足，提供一种降解蛋白质的产朊假丝酵母单基因表达菌株及其构建方法，用于解决降解餐厨发酵液中蛋白质的问题。本专利技术采取的技术方案是，提供一种降解蛋白质的产朊假丝酵母单基因表达菌株，所述产朊假丝酵母单基因表达菌株为将羧肽酶基因通过产朊假丝酵母表达载体整合至产朊假丝酵母基因组上构建而成。本专利技术的重点在于构建了一种能够降解蛋白质的产朊假丝酵母单基因表达菌株，将羧肽酶基因转入产朊假丝酵母并使其分泌表达，所选用的工具为产朊假丝酵母表达载体。其中，羧肽酶，可以有选择的从蛋白质的C端水解产生相应的氨基酸一种蛋白酶，在多种生物体中都能够找到羧肽酶酶分子的酶原形式。羧肽酶参与了机体中多个器官的新陈代谢。此外，在医药应用上，很多机体中产生的不良物质，都依赖于羧肽酶的水解。现在生产羧肽酶的主要来源是微生物自身代谢产生的羧肽酶或以微生物为宿主过量表达的羧肽酶。产朊假丝酵母在生产和生活中得到了广泛的应用，是美国食品和药品管理局认证的可视为安全的微生物菌株，产朊假丝酵母具有一系列优良的特性；培养条件简单，可以在一些简单的培养条件下就可以进行生长，而且具有五六碳糖双糖共转运系统，能够实现戊糖和己糖的共用，拓宽了应用范围；因自身不分泌胞外蛋白酶，产朊假丝酵母可以被应用于多种目标蛋白的表达，其本身作为一种生物安全性生物，只需要经过简单的分离纯化程序目标产物的分离，大大节约了生产成本。进一步地，所述的产朊假丝酵母表达载体为产朊假丝酵母单基因表达载体。进一步地，所述产朊假丝酵母表达载体为pcGAPGA。一种降解蛋白质的产朊假丝酵母单基因表达菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：克隆黑曲霉中的羧肽酶基因；S2：将上述羧肽酶基因接入产朊假丝酵母表达载体中，构建重组单基因表达载体；S3：将上述构建得到的重组单基因表达载体用限制性核酸内切酶切割，使之线性化后转化产朊假丝酵母，构建基因重组产朊假丝酵母单基因表达菌株。进一步地，所述步骤S2中包括如下步骤：S21：将克隆得到的羧肽酶基因进行纯化得到pMD19T-pepF克隆载体；S22：将克隆载体pMD19T-pepF和表达载体pcGAPGA进行双酶切；S23：将回收到的羧肽酶目的基因片段与酶切后的pcGAPGA骨架进行连接形成新的质粒pcGAPGA-pepF。进一步地，所述步骤S3中的限制性核酸内切酶为ScaI。进一步地，步骤S3中所述的转化是使用电转化法、冷冻法或化学试剂法进行转化。进一步地，所述步骤S22中，将克隆载体pMD19T-pepF与表达载体pGAPGA同时用XhoI和XbaI两种内切酶进行双酶切。进一步地，所述步骤S1中的羧肽酶基因为黑曲霉的羧肽酶基因pepF。进一步地，所述产朊假丝酵母表达载体为含有CuGAP启动子或ScTEF1启动子的产朊假丝酵母表达载体pGAPGA。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：餐厨垃圾中含有大量的营养物质，其中原有的油脂类和糖类化合物基本被利用完，而餐厨垃圾中的蛋白质类化合物只有很少的一部分被微生物生长所利用，大部分蛋白质以废弃物的形式残留在发酵残液中。鉴于此，本专利技术提供了一种降解蛋白质的产朊假丝酵母单基因表达菌株，对餐厨发酵残液进行处理，将其中的有机物进一步利用，将大量的蛋白质分解转变成氨基酸，不仅可以解决残存的蛋白质污染问题，氨基酸还是制药、生物饲料、有机肥的原材料，具有一定的经济价值。本专利技术的难点在于将羧肽酶基因通过产朊假丝酵母表达载体，一起转入产朊假丝酵母同时实现分泌表达。附图说明图1为本专利技术羧肽酶表达载体pcGAPGA-pepF的构建流程图。图2为重组蛋白酶酶活的测定酪氨酸标准曲线。图3为羧肽酶Bc-S1和Bc-S2基因电泳。图4为重叠PCR扩增pepF基因电泳。图5为羧肽酶阳性克隆鉴定。图6为各类羧肽酶菌液PCR电泳。图7为各类羧肽酶重组酵母基因组PCR电泳。图8为不同种类的蛋白酶酶活。具体实施方式本专利技术附图仅用于示例性说明，不能理解为对本专利技术的限制。为了更好说明以下实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；对于本领域技术人员来说，附图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种降解蛋白质的产朊假丝酵母单基因表达菌株，其特征在于，所述产朊假丝酵母单基因表达菌株为将羧肽酶基因通过产朊假丝酵母表达载体整合至产朊假丝酵母基因组上构建而成。

【技术特征摘要】
1.一种降解蛋白质的产朊假丝酵母单基因表达菌株，其特征在于，所述产朊假丝酵母单基因表达菌株为将羧肽酶基因通过产朊假丝酵母表达载体整合至产朊假丝酵母基因组上构建而成。2.根据权利要求1所述的一种降解蛋白质的产朊假丝酵母单基因表达载体，其特征在于，所述的产朊假丝酵母表达载体为产朊假丝酵母单基因表达载体。3.根据权利要求1所述的一种降解蛋白质的产朊假丝酵母单基因表达菌株的构建方法，其特征在于，所述产朊假丝酵母表达载体为pcGAPGA。4.根据权利要求1至3任一项所述的一种降解蛋白质的产朊假丝酵母单基因表达菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：克隆黑曲霉中的羧肽酶基因；S2：将上述羧肽酶基因接入产朊假丝酵母表达载体中，构建重组单基因表达载体；S3：将上述构建得到的重组单基因表达载体用限制性核酸内切酶切割，使之线性化后转化产朊假丝酵母，构建基因重组产朊假丝酵母单基因表达菌株。5.根据权利要求4所述的一种降解蛋白质的产朊假丝酵母单基因表达菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中包括如下步骤：S21：将克隆得到的羧肽酶基因进行纯化得到pMD19T-pepF克隆载体；S22：将克隆载体pM...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘泽寰，林蒋海，孙涛，
申请(专利权)人：广东利世康低碳科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44