适用动物源性食品班布特罗胶体金快速检测卡及制备方法技术

本发明专利技术旨在提供一种适用动物源性食品班布特罗胶体金快速检测卡及制备方法。制备获得的班布特罗胶体金快速检测卡具有灵敏度高、特异性强、稳定性高、操作简单、便于携带等特点，不需要复杂的仪器设备和专业的技术人员，其分析结果易于判断，短时间内可直接用肉眼观察到检测结果，广泛适用于快速食品检测等现场检测分析，在班布特罗监测领域具有广泛的实用性和开发价值。

Application of Bambuterol Colloidal Gold Rapid Detection Card for Animal Origin Food and Its Preparation Method

【技术实现步骤摘要】
适用动物源性食品班布特罗胶体金快速检测卡及制备方法
本专利技术主要涉及免疫检测的
，具体地说，本专利技术涉及一种班布特罗胶体金快速检测卡及其制备方法的

技术介绍
班布特罗(bambuterol，CIM)是由Astra公司开发，1987年上市。为亲脂性的叔丁舒喘宁的前体药物，可延长母体药物作用的时间。有较强的支气管扩张作用。用于阻塞性呼吸道疾病，如支气管性气喘、慢性支气管炎震颤和心脏副作用。班布特罗属β2型兴奋剂，研究比较广泛，是继莱克多巴胺、克伦特罗和沙丁胺醇之后的新一代β-肾上腺素受体类激动剂。较大剂量地使用班布特罗，还可以减少胴体的脂肪含量，提高瘦肉率，促进家畜生长、达到改善肉质的效果，因此被作为饲料添加剂非法用于动物源性食品生产中。而长期使用会造成班布特罗在可食性动物组织内蓄积残留，引起食用者中毒。有震颤、头痛、强直性肌肉痉挛、心悸、心动过速等，特别是对冠心病高血压患者、老年人容易产生危害，严重的甚至有生命危险。班布特罗作为新型“瘦肉精”物质，检测手段滞后，尤其是快速检测产品缺乏，目前已建立的检测班布特罗的方法有高压液相色谱法(HPLC)、液相色谱一质谱联用法(LC-MS)、超高效液相色谱一串联质谱分析方法(μPLC-MS/MS)、气相色谱一质谱联用法(GC-MS)、高效毛细管区带电泳法(CZE)、酶联免疫吸附法(ELISA)等。这些方法操作需要对操作人员进行特殊培训，且实验结果不能立即显示，因此不适用于商检生产者对怀疑对象的快速在线检测和监控。因此急需适合批量、快速筛选的快速检测方法，以满足政府和企业的检测需要。胶体金检测卡是以胶体金作为免疫层析的指示物，其原理是以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体(如抗体或抗原)发生高特异高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带)，通过直接运用可目测的胶体金标记物而得到直观的实验结果。
技术实现思路
针对目前国内对于班布特罗的检测尚无灵敏度高、特异性强、稳定性高、操作简单、便于携带的检测方法的技术问题，本专利技术旨在提供班布特罗胶体金快速检测卡及其制备方法，通过制备班布特罗单克隆抗体，制备检测班布特罗的检测卡，获得一种适用动物源性食品的班布特罗胶体金快速检测卡，该检测卡灵敏度高、特异性强、稳定性高、操作简单、便于携带，在班布特罗监测领域具有广泛的实用性和开发价值。本专利技术通过以下技术方案实现的：本专利技术提供一种适用动物源性食品的班布特罗胶体金快速检测卡，包括含有胶体金标记的班布特罗单克隆抗体溶液喷涂的金标垫、绘有T线和C线的NC膜、样品垫以及吸水垫，进行组装。其中，T线使用1.5μL/mL人工制备的班布特罗单克隆抗体T液进行绘制，C线使用250倍稀释的PC-2羊抗鼠的C液进行绘制。本专利技术中，所述一种适用动物源性食品的班布特罗胶体金快速检测卡的具体制备过程为：(1)选取1.35％红色金颗粒标记取1mL胶体金溶液于2mL试管中，加入0.2MK2CO31.5-3.0μL/mL，混匀；加入抗体原液0.5-2.5μL，混匀后静置5min；加入含10％BSA的封闭液10μL/mL，混匀后静置5min；4℃，12000r/min离心，5min；1/20体积的复溶液复溶，喷涂于已封闭好的玻璃纤维素膜上，迅速转移至冷冻干燥机内进行冷冻干燥，制作成为金标垫；(2)用包被液将抗原稀释，将PC-2羊抗鼠250倍稀释制得C液，将制得的人工抗原50倍稀释获得T液；(3)将步骤(2)中制备获得的C液、T液分别在NC膜上划线，从左至右顺序依次为T液和C液，置37℃干燥20～40min，干燥后浸没入封闭液封闭，置于37℃恒温箱中干燥备用；(4)将步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)中制备获得的样品垫、金标垫、NC膜以及吸水垫裁剪为宽度相同的长方形，依次进行重叠组装，并设置加样孔，组装成检测班布特罗的检测卡。本专利技术中，所述的金标垫制备过程中加入0.2MK2CO3的量为1.5μL/mL。本专利技术中，所述的金标垫制备过程中加入抗体原液的量为1.5μL。本专利技术中，所述T液，用制备获得的人工班布特罗抗体进行50倍稀释的溶液。本专利技术中，所述C液，用PC-2羊抗鼠稀释250倍获得的溶液。本专利技术中，所述检测卡为检测班布特罗含量，检测卡包括，使用制备获得的班布特罗单克隆抗体溶液喷涂的金标垫、使用班布特罗单克隆抗体的T液绘制的T线和以及使用PC-2羊抗鼠的C液绘制C线的NC膜、样品垫以及吸水垫，进行组装。本专利技术中，所述班布特罗的单克隆抗体制备过程为：选取约10只Balb/c小鼠作为免疫动物，免疫原为班布特罗半抗原-BSA，三至四次皮下多点注射，最后一次为腹腔加强免疫；利用SP2/0小鼠骨髓瘤细胞与优选小鼠的脾细胞进行细胞融合，融合后经培养、观察、检测及阴阳性对照试验获得理想的细胞株及抗体；对所获得的特异阳性细胞株均进行小鼠腹水(抗体)制备，经腹水检测，不同的细胞株产生的腹水效价等方面存在一定的差异，最高抗体效价可达到1:16W；将获得单克隆抗体，冻干备用。本专利技术中，所述的检测用包被原为班布特罗半抗原-OVA。另外，本专利技术提供一种适用动物源性食品的班布特罗胶体金快速检测卡的应用，具体包括以下步骤：(1)将待固态检样品于均质器中均质1min，10000rpm；称取5.0±0.05g匀浆好的组织样本至10mL聚苯乙烯离心管中，扣上管盖，不宜太紧；放入80℃水浴锅中水浴10min后取出冷却至室温，待检；液态待检样品用干燥、洁净的离心管或适当容器采集50mL左右，如果不立即检测，在2-8℃冷藏可保存24小时，注意避免腐败造成失效或污染；(2)使用前将检测卡和待检样本溶液恢复至室温，从原包装袋中取出检测卡，将检测卡平放，用滴管吸取步骤(1)中获得的待检样品溶液，垂直滴加3滴于加样孔中，加样后开始计时3-5分钟观察T线及C线的出现情况；(3)待步骤(2)中检测卡中C线出现代表结果有效；检测卡中T线及未出现代表则表示样品中班布特罗浓度高于0.01ppb；检测卡中T线与C线同时出现，说明待检样品中不含有班布特罗或其浓度低于0.01ppb，纸条中C线未出现，代表结果无效。通过实施本专利技术的技术方案，可以达到以下有益效果。本专利技术提供一种适用动物源性食品的班布特罗胶体金快速检测卡及其制备方法，基于免疫学的检测方法，通过制备班布特罗单克隆抗体，并分制备检测班布特罗的检测卡，获得一种班布特罗胶体金快速检测卡，该检测卡能够快速、便捷的进行食品中班布特罗的检测，且最好抗体效价达到1：16万，灵敏度达到0.1ppb，能够满足日常生产加工、快速检测的需要。附图说明图1显示为检测卡组装示意图。图2显示为人工制备单克隆抗体显色效果鉴定图。图3显示为人工制备单克隆抗体纯化效果鉴定图。图4显示为胶体金快速检测卡PH的优化效果鉴定图。图5显示为抗体标记量的优化效果鉴定图。图6显示为班布特罗胶体金快速检测卡样本模拟检测效果图。图7显示为班布特罗胶体金快速检测卡检测结果判定图。具体实施方式下面，举实施例说明本专利技术，但是，本专利技术并不限于下述的实施例。采用的主要试剂：玻璃纤维素膜购自上海金标生物科技有限公司，NC膜(硝酸纤维素膜)购自上海金标生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适用动物源性食品的班布特罗胶体金快速检测卡，其特征在于，包括人工制备的班布特罗单克隆抗体和PC‑2羊抗鼠抗体成分的胶体金快速检测卡。

【技术特征摘要】
1.一种适用动物源性食品的班布特罗胶体金快速检测卡，其特征在于，包括人工制备的班布特罗单克隆抗体和PC-2羊抗鼠抗体成分的胶体金快速检测卡。2.如权利要求1所述的一种适用动物源性食品的班布特罗胶体金快速检测卡，其特征在于，所述检测卡为检测班布特罗成分，检测卡包括：包括含有胶体金标记的班布特罗单克隆抗体溶液喷涂的金标垫、绘有T线和C线的NC膜、样品垫以及吸水垫，进行组装。3.一种适用动物源性食品的班布特罗胶体金快速检测卡的制备方法，其特征在于，所述胶体金快速检测卡的制备具体过程为：（1）选取1.35%红色金颗粒标记取1mL胶体金溶液于2mL试管中，加入0.2MK2CO31.5-3.0µL/mL，混匀；加入抗体原液0.5-2.5µL，混匀后静置5min；加入含10%BSA的封闭液10µL/mL，混匀后静置5min；4℃，12000r/min离心，5min；1/20体积的复溶液复溶，喷涂于已封闭好的玻璃纤维素膜上，迅速转移至冷冻干燥机内进行冷冻干燥，制作成为金标垫；（2）用包被液将抗原稀释，将PC-2羊抗鼠250倍稀释制得C液，将制得的人工抗原50倍稀释获得T液；（3）将步骤（2）中制备获得的C液、T液分别在NC膜上划线，从左至右顺序依次为T液和C液，置37℃干燥20~40min，干燥后浸没入封闭液封闭，置于37℃恒温箱中干燥备用；（4）将步骤（1）、步骤（2）、步骤（3）中制备获得的样品垫、金标垫、NC膜以及吸水垫裁剪为宽度相同的长方形，依次进行重叠组装，并设置加样孔，组装成检测班布特罗的检测卡。4.如权利要求3所述的一种适用动物源性食品的班布特罗胶体金快速检测卡的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭燕，李鹏，田杰，刘荣荣，陆武，张潇耀，陈思敏，曼古努尔·尼合买提，张艳，包文雯，
申请(专利权)人：克拉玛依市市场监督管理局，
类型：发明
国别省市：新疆,65