一种快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法，包括以下步骤：S1、菌悬液的制备：取多种微生物菌种分别制备成菌悬液，每种菌悬液中微生物的浓度为10

A Rapid Method for Determining the Antiseptic Effectiveness of Plant Preservative KM

【技术实现步骤摘要】
一种快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法
本专利技术涉及防腐
，具体涉及一种快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法。
技术介绍
由于化妆品的制备材料中通常包含多种有机物，这些有机物可为微生物提供碳源和氮源，同时，化妆品通常还含有水分，极易滋生细菌等微生物。因此，化妆品在生产、储藏和使用过程中极易受到不同程度的微生物污染。根据《化妆品安全技术规范》(2015版)的规定，可依据造成污染的微生物来源，将化妆品中发生的污染分为一次污染和二次污染。一次污染是指化妆品在生产过程中导致的污染，可通过对生产设备、人员操作进行控制；二次污染指化妆品使用过程中造成的污染，这一污染较难控制。同时，该规范中还对化妆品中微生物的限度给出了明确规定；目前，化妆品行业内评价防腐体系的防腐效力是采用美国化妆品盥洗用品和香水协会(Cosmetic，ToiletryandFragranceAssociation，CTFA)的评价方法，该方法的评价结果有效可靠，但需要历经28天的防腐挑战试验，加上前期的微生物培养及菌液浓度确定和防腐测试总计需要58天左右。然而，对于前期确定防腐剂是否有防腐效力来说，若使用该评价方法，则会使得时间成本太高，不利于推进整个实验进程。因此，如何快速且有效地定性确定防腐剂是否对化妆品中限定微生物有杀菌、抑菌效果是化妆品领域中亟待解决的问题。植物防腐剂KM(中文名：茵陈蒿花提取物/萝卜根发酵滤液/牡丹根提取物，INCI：ARTEMISIACAPILLARISFLOWERandEXTRACT，RADISHROOTFERMENTFILTRATEandPAEONIASUFFRUTICOSAROOTEXTRACT)，是一种常用的天然防腐剂。由于来源广泛且对人体伤害小，在各种化妆品的制备中具有广泛的应用前景。在应用于化妆品前需对其防腐效力及最佳浓度进行测定，现有技术中，针对植物防腐剂KM的前期定性防腐效力通常采用纸片法进行测定，然而传统纸片法未能完全反映防腐剂的防腐效力，仍需进一步改善。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种评价结果有效可靠且操作简便的快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法，包括以下步骤：S1、菌悬液的制备：取多种微生物菌种分别制备成菌悬液，每种菌悬液中微生物的浓度为105～106cfu/ml，所述微生物包括大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白假丝酵母菌、黑曲霉菌和肺炎克雷伯氏菌；S2、试验平板的制作：在已灭菌的平板中分别加入所述步骤S1制得的菌悬液，然后在每块所述平板上打孔，去除孔内的培养基并向孔内加入防腐剂，将加入防腐剂后的平板在培养箱中培养，其中，含细菌类微生物的平板在37℃下培养24h，含有真菌类微生物的平板在28℃下培养3天，霉菌类微生物的平板在28℃下培养5～7天，防腐剂的添加量为0.00125～0.02mg/ml；S3、抑菌圈的测量：测量培养结束后的各平板中的抑菌圈直径，根据抑菌圈直径的大小定性判定植物防腐剂KM的防腐效力；若所述抑菌圈直径小于10mm，则判定所述植物防腐剂KM的抑菌效果较差；若所述抑菌圈直径在10mm以上，判定所述植物防腐剂KM的抑菌效果较好且抑菌圈的直径越大，抑菌效果越好。优选地，若所述抑菌圈的直径大于20mm，则表明抑菌效果极佳。优选地，所述防腐剂的添加体积为10～20μl；优选为15μl。优选地，所述防腐剂的浓度为0.0025g/ml。进一步地，所述步骤S1具体包括以下步骤：将微生物菌种经复苏培养后确定菌液初始浓度，并稀释得到最终浓度为105～106cfu/ml浓度的菌悬液。优选地，将复苏后的微生物菌种培养至第2代或第3代时，确定菌液初始浓度，并稀释得到最终浓度为105～106cfu/ml浓度的菌悬液。优选地，通过稀释涂布平板法确定菌液中微生物的浓度。优选地，所述大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯氏菌均采用Luria-Bertani(LB)培养基进行培养，所述白假丝酵母菌选用麦芽浸膏培养基培养，所述黑曲霉菌选用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PotatoDextroseAgar，PDA)进行培养。进一步地，所述步骤S2中，在已灭菌的平板中添加菌悬液80～120μl，优选为100μl。优选地，所述孔为方孔，所述方孔为0.5cm*0.5cm的正方形结构。本专利技术的有益效果在于：本专利技术方案检测时间短且检测结果可靠，通过本专利技术方案可实现快速确定植物防腐剂KM防腐效力，操作便捷；与传统抑菌圈法相比，本专利技术方案可简去部分繁琐细节操作，检测结果更能真实反映防腐剂的防腐效力；本专利技术方案将判定时间控制在一星期左右，大大提升了评价效率，节省了时间，加快了产品的开发进度，采用大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白假丝酵母菌、黑曲霉菌和肺炎克雷伯氏菌组合判定防腐效力，结果可靠性好，具有良好的工业应用前景。具体实施方式为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以说明。本专利技术的实施例为：一种快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法，包括以下步骤：1)取大肠埃希氏菌(CICC10389)、金黄色葡萄球菌(CICC10384)、铜绿假单胞菌(CICC21636)、肺炎克雷伯氏菌(CICC21519)、白假丝酵母菌(CICC1965)、黑曲霉菌(CICC2487)共6种微生物的菌种；2)将大肠埃希氏菌(CICC10389)、金黄色葡萄球菌(CICC10384)、铜绿假单胞菌(CICC21636)、肺炎克雷伯氏菌(CICC21519)用LB培养基进行培养，白假丝酵母菌(CICC1965)用麦芽浸膏培养基进行培养，黑曲霉菌(CICC2487)选用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)进行培养；3)取大肠埃希氏菌菌种冷冻干粉中加入附带悬液稀释液600μL，溶解冻干粉，溶解冻干粉，取100μL接种至平板中，用灭菌涂布棒涂抹均匀；用灭菌接种环蘸菌悬液，在斜面培养基中划线接种；取100μL菌悬液至10ml液体培养基中；4)重复上述操作制作接种其他5种菌的培养基，每种菌重复3次；固体培养基静置培养，液体培养基振荡培养，完成菌种复苏(即一代培养)；5)将各种菌培养至3代时，用稀释平板计数法(稀释7个浓度)，确定菌液浓度，配制105～106cfu/ml；6)将悬菌液加入到灭菌平板上，用灭菌小刀在试验平板上切割正方形(0.5cm×0.5cm)孔结构，用镊子将中间培养基挑去，往正方形孔中加入防腐剂(购自于广州启正化工科技有限公司)，细菌(大肠埃希氏菌(CICC10389)、金黄色葡萄球菌(CICC10384)、铜绿假单胞菌(CICC21636)、肺炎克雷伯氏菌(CICC21519))培养基在37℃培养箱中培养24h，真菌(白假丝酵母菌)放置28℃下培养3天，霉菌(黑曲霉菌)放置28℃下培养6天；7)用游标卡尺通过十字交叉法测量抑菌圈直径，以直径表示抑菌圈的大小。防腐剂添加量的影响验证如下：1、添加不同体积下浓度为0.00125g/ml的防腐剂后的抑菌效果定性测试结果如下表1所示：表1植物防腐剂KM(浓度为0.00125g/ml)抑菌效果定性结果表从上表1可以看出，当KM的浓度为0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、菌悬液的制备：取多种微生物菌种分别制备成菌悬液，每种菌悬液中微生物的浓度为10

【技术特征摘要】
1.一种快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、菌悬液的制备：取多种微生物菌种分别制备成菌悬液，每种菌悬液中微生物的浓度为105～106cfu/ml，所述微生物包括大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白假丝酵母菌、黑曲霉菌和肺炎克雷伯氏菌；S2、试验平板的制作：在已灭菌的平板中分别加入所述步骤S1制得的菌悬液，然后在每块所述平板上打孔，去除孔内的培养基并向孔内加入防腐剂，将加入防腐剂后的平板在培养箱中培养，其中，含细菌类微生物的平板在37℃下培养24h，含有真菌类微生物的平板在28℃下培养3天，霉菌类微生物的平板在28℃下培养5～7天，防腐剂的添加量为0.00125～0.02mg/ml；S3、抑菌圈的测量：测量培养结束后的各平板中的抑菌圈直径，根据抑菌圈直径的大小定性判定植物防腐剂KM的防腐效力；若所述抑菌圈直径小于10mm，则判定所述植物防腐剂KM的抑菌效果较差；若所述抑菌圈直径在10mm以上，判定所述植物防腐剂KM的抑菌效果较好且抑菌圈的直径越大，抑菌效果越好。2.根据权利要求1所述的快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法，其特征在于：若所述抑菌圈的直径大于20mm，则表明抑菌效果极佳。3.根据权利要求1所述的快速判定植物防腐剂KM防腐效力的方法，其特征在于：所述防腐剂的添加体积为10～20μl；优选为15...

【专利技术属性】
技术研发人员：张嘉恒，廖雅，袁菊懋，张晃淳，苏晶，梁一红，詹憬博，
申请(专利权)人：中科萱嘉医养珠海健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44