鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准试验方法技术

本发明专利技术公开了鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准试验方法，包括建立泰乐菌素对鸡毒支原体的耐药检测方法、制定泰乐菌素对鸡毒支原体的野生型临界值、制定泰乐菌素对鸡毒支原体的药效学临界值、制定泰乐菌素对鸡毒支原体的临床临界值以及参考CLSI公布的折点制定的流程图，符合COWT＞COPD＞COCL,对应的折点值应该选择野生型临界值，得到鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准；通过本发明专利技术方法可以得出鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准，能够为科学养殖提供稳定的用药数据支持，能更科学的进行指导临床用药，安全性高，能有效减缓鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药性产生，保护和维持泰乐菌素的有效性。

Standard Test Method for Determining Resistance of Mycoplasma gallisepticum to Tylosin

【技术实现步骤摘要】
鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准试验方法
本专利技术涉及耐药判断
，尤其涉及鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准试验方法。
技术介绍
感染鸡只的霉形体主要分为鸡败血霉形体和鸡滑膜霉形体两种，其中鸡败血霉形体又称鸡毒支原体，主要感染鸡和火鸡，引起鸡的慢性呼吸道系统传染病，而滑膜霉形体则感染鸡只使其出现关节炎等症状，泰乐菌素作为动物专用药，对畜禽的呼吸道疾病具有良好的治疗作用，并且不易产生药物残留，毒性作用弱，具有极高的安全性，进一步促进了其在兽医临床上的应用。我国目前养殖业用药的不合理已经导致耐药现象的产生，耐药检测具有必要性和紧迫性，为了减缓鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药性产生，保护和维持泰乐菌素的有效性，需要对鸡毒支原体开展耐药监控措施，耐药判定标准是对细菌进行有效耐药监控的科学手段，是判断细菌耐药性的科学准则，为了监测耐药性产生，分析耐药现状和发展规律，更科学的指导临床用药，本专利技术提出鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准试验方法，以解决现有技术中的不足之处。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提出鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准试验方法，通过本专利技术方法可以得出鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准，能够为科学养殖提供稳定的用药数据支持，能更科学的进行指导临床用药，安全性高，能够有效减缓鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药性产生，保护和维持泰乐菌素的有效性。本专利技术提出鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准试验方法，包括以下步骤：步骤一：建立泰乐菌素对鸡毒支原体的耐药检测方法：以金黄色葡萄球菌ATCC29213作为质控菌株，泰乐菌素作为质控药物，测定泰乐菌素对临床分离鸡毒支原体的MIC；步骤二：制定泰乐菌素对鸡毒支原体的野生型临界值，其中野生型临界值用COWT表示：首先从临床感染鸡只中分离获取出鸡毒支原体107株，与实验室保存的标准菌株4株组成共111株鸡毒支原体，然后采用肉汤稀释法测定了泰乐菌素对111株鸡毒支原体的MIC值，将得到的MIC数据带入Ecoffinder软件，进行线性回归模拟，得到不同置信区间下的野生性临界值；步骤三：制定泰乐菌素对鸡毒支原体的药效学临界值，药效学临界值用COPD表示：选取了MIC90的菌株进行鸡胚毒力实验，选择SPF级鸡胚进行鸡胚感染实验，将鸡胚孵化至7日龄，在强光照下找到鸡胚的胚胎并标记其与气室的位置，选择卵黄囊接种方法，接种剂量为106CCU，每日观察鸡胚情况，记录每日鸡胚死亡数量，最终选择M17菌株进行PK-PD试验，制定药效学临界值，将得到的PK-PD数据利用Crystalball7软件进行蒙特卡洛模拟，选取达标率在90％以上所对应的最大MIC值为药效学临界值；步骤四：制定泰乐菌素对鸡毒支原体的临床临界值，临床临界值用COCL表示：选取了5个不同的MIC的菌株进行鸡胚毒力实验，选择SPF级鸡胚进行对鸡毒支原体的毒力鉴定，将鸡胚孵化至7日龄，在强光照下找到鸡胚的胚胎并标记其与气室的位置，实验选择卵黄囊接种方法，接种剂量为106CCU，每日观察鸡胚情况，记录每日鸡胚死亡数量，最终选择M1、M11、M17、M23和M24菌株进行临床治疗试验，制定泰乐菌素对鸡毒支原体的临床临界值，临床试验制定的临床临界值可通过“WindoW”计算、非线性回归和二分树(CART)分析方式进行验证；步骤五：根据泰乐菌素对鸡毒支原体的野生型临界值、泰乐菌素对鸡毒支原体的药效学临界值和泰乐菌素对鸡毒支原体的临床临界值，利用折点制定流程图来制定最终的折点，得出鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准。进一步改进在于：所述步骤一中建立泰乐菌素对鸡毒支原体耐药检测方法时，由于鸡毒支原体可代谢葡萄糖而产酸，该特性可致液体培养基发生pH变化，需要采用颜色变化单位滴度试验进行检验，然后再应用于间接测定培养物的含量。进一步改进在于：所述步骤二中鸡毒支原体的分离获取过程包括菌种分离、菌种纯化、菌种鉴定和菌种保存。进一步改进在于：所述步骤二中首先通过对数转换，进行野生型菌株正态性分布检验，选择属于正态分布的野生型菌株MIC范围，确定MIC分布属于正态分布后，进行非线性回归分析，运用非线性回归方法对转换为对数分布的MIC数据进行多次拟合，首先从最小MIC到分布频率最高的MIC进行拟合，然后每次拟合递增一个MIC梯度，直至拟合的菌株数目与实际菌株数目差异最小，然后确定最佳拟合范围为最小的MIC到菌株数目差异最小的MIC，再使用Excel公式中NORMINV函数，验证野生型菌株的最大取值上限，再通过NORMDST函数确定验证最大上限的概率，最终确定的临界值应该至少包括95％的野生型菌株，利用最后CLSI将这些统计分析步骤进行整合，通过一个Excel软件ECOFFinder分析软件直接对野生型菌株MIC分布数据进行分析，得到泰乐菌素对鸡毒支原体的野生型临界值。进一步改进在于：所述步骤三中鸡胚毒力实验具体过程为：择SPF级鸡胚进行鸡胚感染实验，将鸡胚孵化至7日龄，在强光照下找到鸡胚的胚胎并标记其与气室的位置，在无菌操作台进行试验，用75％左右的医用酒精消毒鸡蛋表面，过程中不可擦掉胚胎和气囊标记，实验选择卵黄囊接种，接种剂量为106CCU，接种方法为：气室端蛋壳消毒后，在气室中央打一小孔，用7号注射器针头垂直刺入约3cm，注射接种菌液约0.2mL，石蜡封口，继续在37℃孵化，每天翻蛋2次。进一步改进在于：所述步骤三中利用Crystalball7软件对药动学数据进行蒙特卡洛模拟得到药动学靶值在不同MIC下的达标率，选择达标率在90％以上所对应的最大MIC值为药效学临界值。进一步改进在于：所述步骤四中制定泰乐菌素对鸡毒支原体的临床临界值时，根据MIC分布范围，选择具有致病力的鸡毒支原体，选择依据：最高峰值MIC、最高峰值MIC左右的、野生型临界值、MIC50、MIC90的MIC的菌株，根据具体MIC分布综合考虑选择5个MIC菌株。进一步改进在于：所述步骤四中菌株的致病力试验是通过鸡胚感染模型试验进行验证，将对数生长期对应菌液通过卵黄囊注射接种于鸡胚，每个鸡胚接种0.3mL同样浓度的菌液，同时以无菌空白肉汤腹腔注射鸡胚作为空白对照组，观察鸡胚死亡情况，选择死亡率高的菌株。进一步改进在于：所述步骤四中临床试验得到的临床临界值可带入“WindoW”算法、SPSS软件中的非线性回归和SalfordPredictiveModeler软件的二分树(CART)分析进行验证，首先先用“WindoW”方法对临床疗效的结果进行分析，测定其参数值MaxDiff和CAR，根据参数值确定临床临界值范围，再根据EUCAST提议的POC与MIC之间的公式，利用SPSS软件中的非线性回归对其所得数据进行拟合，以Log2MIC为自变量，POC为因变量，得到相关系数最高的模型表达式来确定临床临界值范围，最后再将临床试验数据带入SalfordPredictiveModeler软件中，以MIC为预测变量，POC为目标变量，进行二分树(CART)分析来确定临床临界值的范围。进一步改进在于：所述步骤五中首先将野生型临界值、药效学临界值和临床临界值进行比较，当出现野生型临界值等于临床临界值情况时，该值即为折点值；当出现不相等情况时，则比较三个临界值的大小，确定最终的折点值即为鸡毒支原体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准试验方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：建立泰乐菌素对鸡毒支原体的耐药检测方法：以金黄色葡萄球菌ATCC29213作为质控菌株，泰乐菌素作为质控药物，测定泰乐菌素对临床分离鸡毒支原体的MIC；步骤二：制定泰乐菌素对鸡毒支原体的野生型临界值(COWT)：首先从临床感染鸡只中分离获取出鸡毒支原体107株，与实验室保存的标准菌株4株组成共111株鸡毒支原体，然后采用肉汤稀释法测定了泰乐菌素对111株鸡毒支原体的MIC值，将得到的MIC数据带入Ecoffinder软件，进行线性回归模拟，得到不同置信区间下的野生性临界值；步骤三：制定泰乐菌素对鸡毒支原体的药效学临界值(COPD)：选取了MIC90的菌株进行鸡胚毒力实验，选择SPF级鸡胚进行鸡胚感染实验，将鸡胚孵化至7日龄，在强光照下找到鸡胚的胚胎并标记其与气室的位置，选择卵黄囊接种方法，接种剂量为10

【技术特征摘要】
1.鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准试验方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：建立泰乐菌素对鸡毒支原体的耐药检测方法：以金黄色葡萄球菌ATCC29213作为质控菌株，泰乐菌素作为质控药物，测定泰乐菌素对临床分离鸡毒支原体的MIC；步骤二：制定泰乐菌素对鸡毒支原体的野生型临界值(COWT)：首先从临床感染鸡只中分离获取出鸡毒支原体107株，与实验室保存的标准菌株4株组成共111株鸡毒支原体，然后采用肉汤稀释法测定了泰乐菌素对111株鸡毒支原体的MIC值，将得到的MIC数据带入Ecoffinder软件，进行线性回归模拟，得到不同置信区间下的野生性临界值；步骤三：制定泰乐菌素对鸡毒支原体的药效学临界值(COPD)：选取了MIC90的菌株进行鸡胚毒力实验，选择SPF级鸡胚进行鸡胚感染实验，将鸡胚孵化至7日龄，在强光照下找到鸡胚的胚胎并标记其与气室的位置，选择卵黄囊接种方法，接种剂量为106CCU，每日观察鸡胚情况，记录每日鸡胚死亡数量，最终选择M17菌株进行PK-PD试验，制定药效学临界值，将得到的PK-PD数据利用Crystalball7软件进行蒙特卡洛模拟，选取达标率在90％以上所对应的最大MIC值为药效学临界值；步骤四：制定泰乐菌素对鸡毒支原体的临床临界值(COCL)：选取了5个不同的MIC的菌株进行鸡胚毒力实验，选择SPF级鸡胚进行对鸡毒支原体的毒力鉴定，将鸡胚孵化至7日龄，在强光照下找到鸡胚的胚胎并标记其与气室的位置，实验选择卵黄囊接种方法，接种剂量为106CCU，每日观察鸡胚情况，记录每日鸡胚死亡数量，最终选择M1、M11、M17、M23和M24菌株进行临床治疗试验，制定泰乐菌素对鸡毒支原体的临床临界值，临床试验制定的临床临界值可通过“WindoW”计算、非线性回归和二分树(CART)分析方式进行验证；步骤五：根据泰乐菌素对鸡毒支原体的野生型临界值、泰乐菌素对鸡毒支原体的药效学临界值和泰乐菌素对鸡毒支原体的临床临界值，利用折点制定流程图来制定最终的折点，得出鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准。2.根据权利要求1所述的鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准试验方法，其特征在于：所述步骤一中建立泰乐菌素对鸡毒支原体耐药检测方法时，由于鸡毒支原体可代谢葡萄糖而产酸，该特性可致液体培养基发生pH变化，需要采用颜色变化单位滴度试验进行检验，然后再应用于间接测定培养物的含量。3.根据权利要求1所述的鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准试验方法，其特征在于：所述步骤二中鸡毒支原体的分离获取过程包括菌种分离、菌种纯化、菌种鉴定和菌种保存。4.根据权利要求1所述的鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准试验方法，其特征在于：所述步骤二中首先通过对数转换，进行野生型菌株正态性分布检验，选择属于正态分布的野生型菌株MIC范围，确定MIC分布属于正态分布后，进行非线性回归分析，运用非线性回归方法对转换为对数分布的MIC数据进行多次拟合，首先从最小MIC到分布频率最高的MIC进行拟合，然后每次拟合递增一个MIC梯度，直至拟合的菌株数目与实际菌株数目差异最小，然后确定最佳拟合范围为最小的MIC到菌株数目差异最小的MIC，再使用Excel公式中NORMINV函数，验证野生型菌株的最大取...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁宗辉，郝海红，黄安雄，王淑歌，黄玲利，彭大鹏，王旭，陶燕飞，陈冬梅，王玉莲，潘源虎，谢书宇，程古月，瞿玮，谷宇锋，房诗薇，戴新予，黄啸，郭金丽，于耕涛，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42