一种预测典型抗生素与农药联合毒性相互作用的方法技术

本发明专利技术公开了一种预测典型抗生素与农药联合毒性相互作用的方法。运用直接均分射线法设计抗生素与农药二元混合体系，共有5条具有不同浓度配比的射线，建立三种混合培养绿藻的毒性微板分析方法，测试抗生素与农药二元混合物对混合培养绿藻的联合毒性。应用浓度加和与独立作用模型分析混合物对混合培养绿藻的毒性相互作用。本方法既结合了自然水体中多种水藻共生的局面，又结合了实际环境中污染物普遍以混合物形式存在的局面，从而可以更客观、全面地评价实际环境中污染物对环境和生态的潜在威胁。此外，本发明专利技术利用96孔微板吸光法，对比标准锥形瓶绿藻毒性测试，它具有测试简便快速，所需样品体积少，便于多次平行毒性测试等优点。

A METHOD FOR PREDICTING THE INTERACTION BETWEEN TYPICAL ANTIBIOTICS AND PESTICIDES

【技术实现步骤摘要】
一种预测典型抗生素与农药联合毒性相互作用的方法
本专利技术属于环境毒理学领域，特别涉及一种利用羊角月牙藻(Selenastrumcapricornutum)、斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)、蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)三种藻混合培养，预测两种典型抗生素(土霉素(OXY)及环丙沙星(CIP))，与一种典型的三唑类杀菌剂农药(三唑酮(SZT))联合毒性相互作用的方法。
技术介绍
藻类是水生生态系统的初级生产者，对水体的平衡和稳定起着极其重要的作用，是反映水体环境质量的重要指标。羊角月牙藻(Selenastrumcapricornutum)、斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)、蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)作为淡水水体中三种常见的绿藻，因其敏感性，常被用作水体安全评价的实验材料，也是水环境毒理试验的标准藻种。在自然水体中，不存在单一藻种垄断，都是多种水藻共生的局面，研究混合绿藻对环境污染物的毒性反应对于评价污染物对淡水环境的生态风险具有重要意义。水体中农药与抗生素可能会以各种形态和浓度共存，形成各种各样的混合污染物。抗生素与农药作为水体生物乃至人类频繁接触的外源物，会同时被水体生物或人体摄入，可能对其健康产生潜在的影响。药物及个人护理品的广泛使用和不当处置引起的环境效应已经引起了国际环境科学界乃至公众的广泛关注。其中，抗生素是人类日常生活中最广泛接触化学品之一。目前，由于抗生素滥用的现象不断加剧，导致在不同水体环境中均出现不同程度的抗生素残留，特别是目前使用量较大、使用较频繁的土霉素与环丙沙星对水环境以及其中的生物均可能造成重大影响。三唑酮是目前应用最广泛的三唑类广谱杀菌剂之一，在我国的使用量有逐年增长的趋势。三唑酮使用后被土壤吸附和解吸，经雨水淋溶作用进入地表或地下水环境，在丰水期检出率与检出浓度较高，能够在水生生物体内累积代谢，在不同浓度下对不同类群、不同生命阶段的水生生物表现出不同的毒性效应。因此，开展抗生素与农药联合作用研究具有重要的实际意义。目前，已经广泛采用纯培养条件下的单一藻种进行单一抗生素、农药的毒性安全性评价的研究，然而，鉴于在自然水体中，不存在单一藻种垄断，都是多种水藻共生的局面，同时实际环境中不可能存在单一化学物质而普遍以混合物形式存在的局面，采用混合培养条件下的多种藻种进行抗生素与农药联合毒性作用研究鲜有报道。因此，提供一种易操作、实用性强的多种藻种混合培养条件测定农药与抗生素联合作用的方法，为实际水生生态系统的风险评价提供科学依据尤其重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种预测典型抗生素与农药联合毒性相互作用的方法，使之可以更客观、全面地预测抗生素与农药联合作用对环境和生态的潜在威胁。具体步骤为：(1)藻种混合培养：选择纯培养条件下处于对数生长期的羊角月牙藻、斜生栅藻、蛋白核小球藻三种藻，并用血球计数法计算藻细胞浓度，用GB-11培养液稀释保证三种藻相同的初始接种藻细胞浓度，再按比例均匀混合培养。(2)试验液配置：称取抗生素与农药原药，溶于超纯水中配置母液，并将母液稀释至所需浓度，配制成梯度浓度的试验液。(3)空白对照制备：对于溶解性的抗生素与农药，将超纯水作为空白对照；对于不溶或微溶的抗生素与农药，将含有与之对应样品具有相同含量的二甲基亚砜作为空白对照。(4)混合物设计：采用直接均分射线法设计混合物二元混合体系。(5)毒性测试：采用微板吸光法，以96孔微板为载体，将设计好的混合组分试验药液与均匀混合的藻液加入板中，微板加样完后并盖上透明盖密封，静置15min后，将板置于酶标仪中测定光密度值(Opticaldensity,OD)，作为暴露时间t＝0h，然后将测完后的板置于光照培养箱中培养；每天定时将微板交叉调换位置4次，待培养96h后将微板放入酶标仪中测定，作为暴露时间t＝96h。(6)毒性数据处理与拟合：根据t＝0h与t＝96h的光密度值计算藻的抑制率，再采用两参数非线性函数对浓度-效应数据进行非线性最小二乘拟合。(7)混合物毒性相互作用分析：用两种经典混合毒性评估参考模型分析混合物毒性相互作用。所述步骤(1)中的三种藻的初始藻细胞浓度为106个/mL，混合比列为1:1:1。所述步骤(2)中抗生素是指土霉素和环丙沙星；所述农药原药是指三唑酮。所述步骤(3)中的助溶剂二甲基亚砜的体积浓度应控制在5‰之内。所述步骤(4)中直接均分射线法为设计抗生素与农药二元混合体系5条射线，即R1、R2、R3、R4和R5，每条射线组分及其浓度配比不同。所述步骤(5)中培养条件为：温度22℃，光照度2500～3000lux，光暗周期12h:12h。所述步骤(6)中采用基于Matlab软件编辑的MixToxPred_CAIA软件，两参数非线性函数是指Weibull和Logit。所述步骤(7)中两种经典混合毒性评估参考模型指浓度加和(CA)模型与独立作用(IA)模型来预测抗生素与农药联合毒性相互作用。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：(1)本专利技术提供了一种操作简单、测试简便快速、实用性强的混合培养绿藻预测抗生素与农药联合毒性作用的方法；该方法可初步预测出抗生素与农药二元混合毒性相互作用，速度快，精确度高。(2)本专利技术提供了一种多种绿藻在混合培养条件下预测抗生素与农药毒性联合作用的方法，试验周期短，预测结果容易判断，具有简单、易操作的优势。附图说明图1为本专利技术实施例中直接均分射线法示意图。图2为本专利技术实施例中96孔微板加样设计示意图。图3为本专利技术实施例中抗生素与农药二元混合对混合培养绿藻的CA/IA预测图。具体实施方式以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本专利技术而不限于限制本专利技术的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。以下将以举例形式进行说明，如有未详尽之处，可以参见常用的实验手册，以及所用试剂和仪器的厂商说明书。其中，所有化学试剂均采用分析级，实验用水为超纯水，各试剂均和材料可以商用渠道获得，具体而言：实验中所用到的两种抗生素包括：土霉素(OXY)、环丙沙星(CIP)；一种三唑类杀菌剂农药指三唑酮(SZT)，均购自CATOResearchChemicalsInc。所培养的藻种包括羊角月牙藻【FACHB-271】、斜生栅藻【FACHB-12】、蛋白核小球藻【FACHB-5】，均购自中国科学院淡水藻种库。实施例：1.混合藻种培养1.1藻种纯培养：购买藻种，收到藻种后，将试管内藻液摇匀，在无菌操作下直接转入玻璃三角瓶(25～50mL)内，封好瓶口，放置在光照培养箱内弱光照培养2～3天；培养温度25℃，光照条件1000～2000Lux，时间设置为12Hr昼/12Hr夜；2-3天后，取5～10mL相应的藻液加入新鲜BG11培养基定容至100mL，在无菌的三角瓶(250mL)内培养，每天定时摇动三角瓶3次，培养至三代后方可用来做实验。1.2确定初始接种藻细胞浓度：用血球计数法，将处于对数生长期的羊角月牙藻、斜生栅藻、蛋白核小球藻在纯培养下的原液在显微镜下数藻细胞计数，每种藻计数不少于三次，取平均值，并用BG11培养基将原本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种预测典型抗生素与农药联合毒性相互作用的方法，其特征在于具体步骤为：（1）藻种混合培养：选择纯培养条件下处于对数生长期的羊角月牙藻、斜生栅藻、蛋白核小球藻三种藻，并用血球计数法计算藻细胞浓度，用GB‑11培养液稀释保证三种藻相同的初始接种藻细胞浓度，再按比例均匀混合培养；（2）试验液配置：称取抗生素与农药原药，溶于超纯水中配置母液，并将母液稀释至所需浓度，配制成梯度浓度的试验液；（3）空白对照制备：对于溶解性的抗生素与农药，将超纯水作为空白对照；对于不溶或微溶的抗生素与农药，将含有与之对应样品具有相同含量的二甲基亚砜作为空白对照；（4）混合物设计：采用直接均分射线法设计混合物二元混合体系；（5）毒性测试：采用微板吸光法，以96孔微板为载体，将设计好的混合组分试验药液与均匀混合的藻液加入板中，微板加样完后并盖上透明盖密封，静置15min后，将板置于酶标仪中测定光密度值，作为暴露时间t=0h，然后将测完后的板置于光照培养箱中培养；每天定时将微板交叉调换位置4次，待培养96h后将微板放入酶标仪中测定，作为暴露时间t=96h；（6）毒性数据处理与拟合：根据t=0h与t=96h的光密度值计算藻的抑制率，再采用两参数非线性函数对浓度‑效应数据进行非线性最小二乘拟合；（7）混合物毒性相互作用分析：用两种经典混合毒性评估参考模型分析混合物毒性相互作用；所述步骤（1）中的三种藻的初始藻细胞浓度为10...

【技术特征摘要】
1.一种预测典型抗生素与农药联合毒性相互作用的方法，其特征在于具体步骤为：（1）藻种混合培养：选择纯培养条件下处于对数生长期的羊角月牙藻、斜生栅藻、蛋白核小球藻三种藻，并用血球计数法计算藻细胞浓度，用GB-11培养液稀释保证三种藻相同的初始接种藻细胞浓度，再按比例均匀混合培养；（2）试验液配置：称取抗生素与农药原药，溶于超纯水中配置母液，并将母液稀释至所需浓度，配制成梯度浓度的试验液；（3）空白对照制备：对于溶解性的抗生素与农药，将超纯水作为空白对照；对于不溶或微溶的抗生素与农药，将含有与之对应样品具有相同含量的二甲基亚砜作为空白对照；（4）混合物设计：采用直接均分射线法设计混合物二元混合体系；（5）毒性测试：采用微板吸光法，以96孔微板为载体，将设计好的混合组分试验药液与均匀混合的藻液加入板中，微板加样完后并盖上透明盖密封，静置15min后，将板置于酶标仪中测定光密度值，作为暴露时间t=0h，然后将测完后的板置于光照培养箱中培养；每天定时将微板交叉调换位置4次，待培养96h后将微板放入酶标仪中测定，作为...

【专利技术属性】
技术研发人员：覃礼堂，农琼媛，莫凌云，代俊峰，曾鸿鹄，梁延鹏，
申请(专利权)人：桂林理工大学，
类型：发明
国别省市：广西,45